作者：张莹 史俊南 顾淑萍 汪平 郝建军 费俭
【关键词】 基因克隆
关键词: 牙本质涎磷蛋白;基因克隆;原核表达
摘 要:目的 克隆人牙本质涎磷蛋白（DSPP）成熟肽编码区基因片段并进行原核表达. 方法 用异硫氰酸胍一步法从人牙乳头组织中抽提总RNA，用Oligo（dt）作引物逆转录合成牙乳头cDNA，然后利用PCR法，从cDNA中扩增出人DSPP成熟肽基因片段（约600bp），将所得基因片段插入pBluescript质粒载体，转化到大肠杆菌XL1-Blue后挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆;将DSPP基因重组入表达载体pGEX-3X中构建表达载体，并在大肠杆菌BL21中进行表达. 结果 酶切图谱和序列分析与国外文献报道一致，DSPP蛋白在大肠杆菌中得到表达. 结论 克隆到人DSPP成熟肽编码区基因片段，并在原核中得到表达，为进一步研究其功能奠定基础.
Keywords:human dentin sailophosphoprotein;gene clone;prokaryotic expression
Abstract:AIM To clone，sequence and prokaryotic express human dentin sailophosphoprotein（DSPP）.METHODS In the study，total RNA was extracted from the tooth germs of a legally aborted embryo by acid guanidinium thiocyanata-phenol-choroform method，the desired DNA product was ob-tained from the total RNA by RT-PCR with the primers in-cluding Oligo（dt）and two gene specific primers.The seg-ment（about600bp）was inserted into pBluescript vector and the interesting plasmid was transformed into E.coli host strain XL1-Blue.The double stranded DNA of the positive clone was analyzed by restriction endonuclease mapping and DNA sequencing.DSPP was then cloned into expression vec-tor pGEX-3X and expressed in E.coli BL21.RESULTS The restriction endonuclease map and sequence of human DSPP encoding mature protein were consistent with those of the references published.DSPP protein was successfully ex-pressed in prokaryocytes.CONCLUSION The human DSPP cDNA encoding mature protein could be obtained and thus have laid a foundation for future function researches.
0 引言
牙本质涎磷蛋白（dentin sailophosphoprotein，DSPP）是近年发现的牙本质特异蛋白，其确切功能尚不清楚，可能参与了成牙本质细胞的分化和矿化.目前普遍认为DSPP是成牙本质细胞分化的唯一客观指标，而且DSPP是牙本质发育不全（dentinogenesis imperfecta，DGI）Ⅱ型的重要候选基因［1］ .为了深入研究DSPP的生物学功能，分析和探讨成牙本质细胞分化及牙本质形成机制，从基因水平揭示人类牙本质发育不全Ⅱ型的发病机制，用基因工程的方法表达有活性的DSPP蛋白，本实验利用人牙胚组织，根据报道的人DSPP cDNA基因序列设计PCR引物，采用逆转录PCR方法，克隆到DSPP成熟区基因片段，对其进行核苷酸序列分析，并在原核细胞中进行表达.
1 材料和方法
1.1 材料 人牙胚的来源和获取:本实验所用人牙胚来源于合法引产人胚胎.无菌条件下暴露牙龈部位，挑开牙龈组织，挖取乳切牙、乳尖牙、乳磨牙，立即置液氮中冻存，-70℃下长期保存.总RNA的提取:磨碎冻存的人牙胚组织，在盛有预冷的变性缓冲液（德国宝灵曼公司）的匀浆器中充分破碎组织细胞，组织与缓冲液的比例为1 10.用异硫氰酸胍一步法从牙胚组织中提取总RNA，并进行电泳鉴定.
1.2 方法
1.2.1 cDNA的合成和PCR扩增 根据报道的人DSPP的cDNA序列，采用PCGene设计PCR扩增的两条引物:5’端引物为GGTGTCCTGGTG-CATGAAGGT，3’端引物为CTTCGTCTTCATC-CTCATCTG，由中国科学院上海细胞生物学研究所基因工程组合成.用Gibco公司的Super Script TM试剂盒，按其说明进行逆转录（RT）合成cDNA第一链，以其为模板，PCR扩增出人DSPP成熟区基因片段（美国MJ Research公司PTC-150型PCR仪）.Taq PlusⅡDNA聚合酶购于中科院上海生理研究所生工公司.
1.2.2 PCR产物的克隆和酶谱分析 PCR产物用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段（Premega公司）补平，将载体pBluescriptKS（pBS）用EcoRⅠ酶切，然后用10g L-1 琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切取目的片段和载体，用柱式胶回收试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）回收PCR目的片段和载体pBS，T4 DNA连接酶16℃连接过夜，制备大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，转化连接产物，蓝白斑筛选阳性克隆pBS-hDSPP.碱裂解法快速提取pBS-hDSPP质粒DNA，用EcoRⅠ单酶切和SalⅠ加PstⅠ双酶切鉴定目的基因是否插入质粒载体中.
1.2.3 核苷酸序列分析 将酶切鉴定正确的pBS-hDSPP重组质粒再转化XL1-Blue感受态细胞，培养扩增，用T3，T7作引物，利用计算机自动测序仪进行核苷酸序列分析.
1.2.4 表达载体构建及蛋白质表达 从pBS-hD-SPP重组载体中用BamHI和XholI双酶切切出hD-SPP基因，重组入表达载体pGEX-3X中，构建重组表达载体.重组载体经酶切鉴定证实构建成功.将鉴定正确的重组表达载体和pGEX-3X空载体分别转化大肠杆菌BL21，DH5а，JM109，XL1-Blue等，琼脂糖固体培养板培养16h，挑选菌落接种于含氨苄的LB培养基中培养16h，按1%比例分别转种3mL含氨苄的LB培养基，经37℃振荡培养4h后，IPTG诱导2～4h后，用150g L-1 SDS-PAGE电泳来检测蛋白质表达情况.
2 结果
2.1 总RNA 提取的人牙胚总RNA电泳（Fig1）， 可见28s，18s和5s三条带，其中28s的带最亮，约为18s带的2倍，表明所获得的总RNA无明显降解.
图1 略
2.2 RT┐PCR 牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后，可见大小约600bp的特异扩增产物（Fig2）.
2.3 pBS┐hDSPP克隆的酶谱分析（Fig2） 重组质粒pBS-hDSPP经EcoRⅠ单酶切后有两条带3.39kb和0.18kb;重组质粒pBS-hDSPP经SalⅠ加PstⅠ双酶切后也为两条带，2.96kb的空载体和0.6kb的插入片段.pBS-hDSPP酶切图谱与预期的完全相同.
2.4 pBS┐hDSPP的序列分析 DSPP成熟肽编码区基因重组质粒pBS-hDSPP核苷酸的测序结果，可读出的600个碱基序列与Gu等［2］ 报道的结果完全相同.
2.5 pGEX┐3X┐hDSPP在大肠杆菌内的表达 重组菌有一明显的46Mr ×103 左右新生蛋白条带，其中BL21菌株表达量最高，诱导的空载体在26Mr ×103 处出现一条新生蛋白条带，与GST蛋白大小一致（Fig3）.
图3 略
3 讨论
牙本质细胞外基质是由成牙本质细胞合成和分泌的，由胶原和非胶原蛋白组成.胶原成分组成矿化的基质，起支架作用，而非胶原蛋白参与了矿化的起动和调节.牙本质磷蛋白（dentin phosphoprotain，DPP）和牙本质涎蛋白（dentin sailoprotain，DSP）为已知的两种牙本质特异性蛋白，分别在1967年和1987年在牙本质基质提取物中发现的［3，4］ .DPP占非胶原蛋白的50%，在矿化过程中起着成核作用，能够调节羟基磷灰石晶体的形态、大小、和生长速度，是牙本质稳定的关键调节因子;DSP占牙本质非胶原蛋白的5%左右，其具体功能还不清楚.1997年，MacDougall根据小鼠DSP cDNA序列合成的寡核苷酸简并引物来筛选小鼠磨牙cDNA文库，成功地克隆了同时编 码DSP和DPP的cDNA，发现二者共存于由其命名的DSPP基因的连续开放读框内［5］ .这一发现随后在大鼠和人的基因水平获得证实［2，6］ .
人的DSPP全长4187bp，开放读框3759bp，含有5个外显子和4个内含子，与小鼠DSPP高度同源，外显子1～4编码DSP，外显子5编码DSP的C末端和DPP.该蛋白富含天门冬氨酸和丝氨酸，是酸性非常强的蛋白，等电点为3.4，推测Mr 为124.6×103 .
DSPP在牙本质形成和矿化过程中起着相当重要的作用，近来研究表明DSPP是人类牙本质发育不全Ⅱ型的重要候选基因，是目前国内外学者研究的热点课题.虽然该基因序列已经报道，但其具体功能尚不清楚.我们根据Gu等［2］ 报道的人DSPP序列设计引物，采用RT-PCR法克隆到了人DSPP成熟肽编码区cDNA基因片段，该基因片段位于DSPP基因的第四外显子.在此基础上又构建了DSPP基因的表达载体，并成功地在大肠杆菌中进行了表达，为获得DSPP抗体，研究其功能奠定了基础.
参考文献:
［1］MacDougall M.Refined mapping of the human dentin sailophos-phoprotein（DSPP）gene within the critical dentinogenesis im-perfecta typeⅡand dentin dysplasia typeⅡloci ［J］.Eur J Oral Sci，1998;106（Suppl1）:227-233.
［2］Gu K，Chang S，Ritchie HH，Clakson BH，Rutherford RB.Molecular cloning of a human dentin sailophophoprotein gene ［J］.Eur J Oral Sci，2000;108（1）:35-42.
［3］Veis A，Perry A.The phosphoprotain of the dentin matrix ［J］.Biochemistry，1967;6（4）:2409-2416.
［4］Butler WT.Dentin specific proteins ［J］.Methods Enzymol，1987;145（1）:290-303.
［5］MacDougall M，Simmons D，Luan XH，Nydegger J，Feng J，Gu TT.Dentin phosphosprotein and dentin sailoprotein are cleavage products expressed from a single transcript coded by a gene on human chromosome4［J］.J Biol Chem，1997;272（2）:835-842.
［6］Rithchie HH，Wang LH.A mammalian bicistronic transcript en-coding two dentin-specific proteins ［J］.Biochem Biophy Res Commun，1997;231（1）:415-428.
［7］Feng JQ，Luan XH，Wallace J，Jing D，Ohshima Toshio，Kulkarni Ashok B，D’Souza N，Kozak Christine A，MacDougall M.Genomic organization，chromosomal mapping，and promoter analysis of the mouse dentin sailophosphoprotein（DSPP）gene，which codes for both dentin sailoprotein and dentin phophopro-tein ［J］.J Biol Chem，1998;273（16）:9457-9464.