作者：吴小军 高国栋 吕葆真 李立宏
【关键词】 帕金森病
关键词: 帕金森病;神经节苷脂类;脱噬作用
摘 要:目的 探讨神经节苷脂（ganglioside GM1）对帕金森病（Parkinson’s disease，PD）的治疗机制. 方法 以左旋多巴（L-dopa）处理的PC12（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤）细胞为多巴胺（Dopamine，DA）神经元的细胞凋亡模型，应用透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪及免疫组化等技术，观察GM1对凋亡中的PC12细胞的影响. 结果 24h后空白对照组凋亡率为2.5%，200μmol L-1 L-dopa处理组的凋亡率为61.6%;100，50和10μmol L-1 的GM1各加200μmol L-1 L-dopa处理组24h的凋亡率分别为29.7%，52.3%，55.7%，与L-dopa处理组比较有显著差异（P&<0.05）. 结论 在一定浓度范围内的GM1可抗L-dopa诱导的PC12细胞的凋亡，并提示GM1抗凋亡作用可能在于其对神经细胞膜的保护.
Keywords:parkinson’s disease;gangliosides;apoptosis
Abstract:AIM To explore the mechanism of the protection effect of the ganglioside GM1in the treatment of Parkinson’s disease.METHODS We built a cellular apoptotic model with PC12cells treated with L-dopa，using the flow cytome-try，electron microscope and electrophoresis immuno-histo-chemical technology to observe whethe the GM1could pro-tect the PC12cells from apoptosis.RESULTS The ratios of apoptosis of the control group and GM1-treated group at the ranges of100，50and10μmol L-1 were2.5%，29.7%，52.3%，55.7%respectively，significantly lower than that of the L-dopa treated group（P&<0.05）.CONCLUSION GM1could protect the PC12cells from apoptosis，and the mecha-nism might be the protection of the cellular membrane.
0 引言
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的中枢神经系统变性疾病，其特征性病理改变是黑质多巴胺能神经元进行性死亡，导致正常运动消失，出现运动迟缓或震颤.传统的治疗方法是口服左旋多巴（L-dopa）等药物或外科手术［1］ .药物治疗后期疗效下降，其原因与L-dopa对多巴胺能细胞的毒性有关.而神经节苷脂（ganglioside GM1）是存在于哺乳类动物神经组织中的一种重要的神经节苷脂，其活性成分是单唾液酸四己糖神经节苷脂.它具有促进神经生长的作用，对损伤后的神经组织有营养和修复等功能.临床上应用GM1治疗周围神经损伤、脊髓损伤和中风等，甚至有学者［2］ 将其试用于AD的治疗.本实验即是在此基础上，研究GM1抗L-dopa诱导的凋亡作用，探讨GM1可能的抗凋亡机制，为GM1应用于PD的治疗提供相应的理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料 流式细胞仪（美国Coulter公司），JEM-2000EX型透射电镜（日本JEOL公司），L-dopa，GM1，胰蛋白酶（美国Sigma生物制品公司），RPMI1640，胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），SABC免疫组化试剂盒、Bcl-2抗体、Bax抗体等试剂均购于武汉博士德生物工程有限公司.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及药物处理 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞由中国科学院上海细胞生物研究所提供，置于850g L-1 RPMI1640培养液中，内含100mL L-1 胎牛血清，谷胺酰胺2mmol L-1 ，青霉素5×104 U L-1 ，链霉素25mg L-1 ，培养瓶中预先铺以0.2g L-1 鼠尾胶，37℃，50mL L-1 CO2 孵箱培养.细胞接种于24孔培养板，在细胞对数生长期加入药物处理.实验分组为:①空白对照组，不加GM1与L-dopa;②L-dopa作用组，加入200μmol L-1 L-dopa;③GM1作用组，加入GM1与L-dopa，GM1终浓度分别为10，50和100μmol L-1 ，L-dopa为200μmol L-1 .
1.2.2 台盼蓝染色评估细胞活性 将5g L-1 的台盼蓝5μL分别加入上述各组处理24h后的细胞悬液40μL中.受损伤或死亡的细胞胞膜破裂，染料进入细胞内与DNA结合，使其染成蓝色.而活细胞因胞膜完整而拒染，通过血细胞计数器随即取3个视野计数，计算平均值.
1.2.3 形态学观察细胞 将部分PC12细胞移植培养皿中，进行细胞爬片.待细胞生长良好时加入L-dopa和GM1处理，培养12h及24h，HE染色，光镜下观察.
1.2.4 流式细胞仪检测 分别取上述分组中处理24h的细胞液经2.5g L-1 胰酶和0.2g L-1 EDTA液消化，制成细胞悬液，调整细胞数至1×109 L-1 ，离心后弃去上清，悬浮于2mL，4℃预冷的PBS中，按每1mL悬液加入2mL4℃冷乙醇的量固定24h，按1 1加入碘化丙啶（PI）染色，4℃放置20～30min，流式细胞仪中进行分析.
1.2.5 透射电镜检查 分别取上述各浓度组12h及24h的细胞悬液离心后弃去上清.加入4℃预冷的2g L-1 戊二醛4mL，4℃固定30min，送电镜室脱水包埋制成超薄切片，透射电镜下观察照相.
1.2.6 DNA琼脂糖凝胶电泳分析 分别取上述各组24h的细胞液，调整细胞数至5×109 L-1 ，裂解液裂解，RNAase、蛋白酶K孵育，酚抽提，乙醇沉淀，每样品提取DNA10μg经10g L-1 琼脂糖凝胶在6V cm-1 电压下进行电泳分析.
1.2.7 免疫组织化学染色 细胞爬片并加药处理3，6，9，12，24和48h后，用SABC试剂盒，第一组行Bcl-2染色，第二组行Bax染色，过程按试剂盒说明操作，并设立空白对照.无阳型反应细胞且背景同空白对照者为阴性（-）;标本阳性细胞率于低于30.0%为（+）;标本阳性细胞率介于30.0%～60.0%为（）;标本阳性细胞率大于60.0%为（）.
2 结果
2.1 经台盼蓝染色测得的各组细胞活性 经台盼蓝染色，空白对照组细胞活性为（95.3±3.8）%;L- dopa处理组的活性为（36.6±2.4）%;GM1浓度为10，50和100μmol L-1 时，PC12细胞活性分别为（44.5±1.2）%，（47.8±1.8）%，（73.3±2.2）%，与L-dopa处理组比较则有显著性的差异（P&<0.05）. 2.2 倒置显微镜下各组细胞形态 L-dopa处理组12h后可见细胞凋亡现象.这种凋亡细胞在倒置显微镜下表现为胞体缩小，密度折光性增强，外形不规则.HE染色可见死细胞增多、脱落，细胞变圆并出现典型的细胞凋亡形态学变化:细胞核固缩、染色质凝集边聚、核仁消失、核碎裂等（Fig1A）.GM1处理组和空白对照组细胞HE染色光镜下可见细胞生长良好，核呈蓝紫色、圆形、胞质呈粉红色.整个细胞呈多角形，细胞密度较大，互相交织呈簇状生长（Fig1B）.
图1 略
2.3 各组细胞形态在透射电子显微镜下的表现 电镜下GM1作用组和空白对照组24h后无明显异常，L-dopa组视野下出现大量异常细胞，可见典型凋亡特征性改变:胞膜出芽，芽内可见核物质.胞核固缩，染色质边集，核膜崩解，内质网肿胀、崩溃、自融.可见凋亡小体（Fig2）.
2.4 流式细胞仪上检测到的各组细胞的凋亡率 流式细胞仪上进行周期分析和DNA含量测定的结果显示:空白对照组的凋亡率为（2.5±1.7）%;100，50和10μmol L-1 GM1处理组的凋亡率分别为（29.7±2.3）%，（52.3±2.1）%，（55.7±3.6）%，较L-dopa组的凋亡率（61.6±0.9）%显著下降（P&<0.05）.
图2 略
2.5 凋亡细胞的梯状电泳结果 从电泳结果可见L-dopa处理后细胞DNA形成了梯状电泳模式，是发生凋亡的标志.10，50μmol L-1 GM1处理组有少量电泳带，100μmol L-1 GM1组和空白对照组未见明显的凋亡降解片段（Fig3）.
图3 略
2.6 组织病理学结果 免疫组化染色中，L-dopa组Bcl-2的表达在第3小时处理时就已出现，以后逐渐增加，至12h表达量最高，以后下降较为迅速，至48h表达量几乎为零.而Bax染色亦在3h出现，以后增加较为迅速，6h以后逐渐下降，但下降的幅度较Bcl-2小.GM1处理组细胞中Bcl-2蛋白表达的变化与前 两组相似，但Bax蛋白量明显降低，阳性细胞比例减少.
PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，常作为研究神经细胞凋亡的细胞模型.又由于它所含的受体及递质与黑质多巴胺能神经元相似，故可用于PD的细胞模型［3］ .L-dopa是临床上治疗PD的常用药物，但长期服用会导致黑质纹状体多巴胺能系统变性，甚至加速病程的进展.实验证明它可能通过细胞凋亡这一途径损害多巴胺神经元
［4］ .
神经节苷脂是位于细胞膜表面的一种含唾液酸的糖鞘脂，主要位于双脂层的外表面.是大多数哺乳动物细胞膜的组成成分，在中枢神经系统中尤为丰富.GM1可作为NGF的结合位点而增强NGF的作用，促进神经再生.但GM1的脑保护作用更主要在于其对神经细胞膜的保护［5］ .
哺乳动物神经系统的Bcl-2蛋白家族包括抑制凋亡的Bcl-2，BclX，Bcl-I及促进凋亡的Bax，Bix，Bak，Bad和Bcl XS.Bcl-2家族成员自身和相互之间形成二聚体，两者的比例决定了细胞是否发生凋亡.过度表达Bax可引起神经细胞的凋亡，Bcl-2过量表达可以抑制凋亡过程［6，7］ .另有证据表明Bcl-2能阻断细胞色素C的释放
［8，9］ ，发生凋亡之前Bax位于胞质内，接收到死亡信息后Bax插入线粒体膜并形成Bax通道，以利于细胞色素C的释放.另外，在凋亡过程中，细胞色素C激活caspase后，激活的caspase反过来可能会促进更多的细胞色素C释放，两者之间可能形成正反馈环路［10］ .
实验结果表明10，50和100μmol L-1 的GM1可以拮抗由L-dopa诱导的PC12细胞凋亡，且呈一定的量效关系，提示GM1可能是通过打断凋亡途径以保护多巴胺神经元.因为免疫组化染色中Bax蛋白量明显降低，这表明GM1可以抑制Bax蛋白的合成，进而抑制了细胞的凋亡.这证实了Bcl-2和Bax表达比例决定细胞是否发生凋亡，为PD的治疗提供了一定的理论依据.进一步分析，GM1抑制Bax蛋白的合成的原因可能在于其对神经细胞膜的保护，阻止了Ca2+ 内流，降低了自由基浓度，防止膜脂质水解，抑制磷脂酶A2 、细胞色素C的活性和兴奋性氨基酸及花生四烯酸等的毒性作用［11］ .提示自由基在PD发病机制中有重要作用，抗氧化作用可能成为PD治疗方法.GM1拮抗由L-dopa诱导的凋亡作用还可以从电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪的结果中看出.从电镜下可见典型凋亡特征性改变.我们知道，细胞凋亡最显著而具特征性的生化特征是DNA降解为大约由180～200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段，在本实验中琼脂糖凝胶电泳就可见特征性的“梯状（Ladder）”带，随着GM1浓度的增大，“梯状”带相对变短，对照组基本未见条带.流式细胞仪的图像也证实了该结果:L-dopa处理组24h后可见细胞增殖明显抑制，细胞周期分布图中出现了明显的亚二倍体峰，这个异常出现的亚二倍体峰代表着细胞凋亡，是凋亡时核固缩及DNA裂解的结果.余两组可见细胞增殖无明显抑制.
总而言之，PD发病机制中多巴胺能细胞的凋亡仍是十分复杂的过程，除了上述的主要代谢途径外，尚有诸多因素参与其中，GM1抗凋亡作用还可能有其他途径，例如抑制蛋白激酶活性，维持细胞和线粒体结构完整性，使线粒体三羧酸功能加强，ATP合成增多等等［12］ .因而要全面而完整地了解GM1拮抗由L-dopa诱导的凋亡机制，达到保护神经系统的应用，仍需进行大量的实验研究和深入的探讨.
参考文献
［1］Gao GD，Zhang H，Zhang BG，Wang QF，He SM，Li YL，Hou F，Chen L，Zhao JP，Li YJ.Application of microelectrode recording in palliditomy for treatment of Parkinson’s disease ［J］.Di-si Junyi Daxue Xubao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（3）:331.
［2］Svennerholm L.Gangliosides-a new therapeutic agent against stroke and Alzheimer’s disease ［J］.Life Sci，1994;55（25-26）:2125-2134.
［3］Shafer TJ，Atchison WD Transmitter，ion channel and receptor properties of pheochromocytoma（PC12）cells:A model for neu- rotoxicological studies ［J］.Neurotoxicology，1991;12（3）:473-492.
［4］Mena MA，Pardo B，Casarejos MJ，Fahn S，Garcia de Yebenes J.Neurotoxicity of levodopa on catecholaminerich neurons ［J］.Mov Disord，1992;7（1）:23-31.
［5］Karpiak SE，Mabadik SP.Reduction of cerebral edema with GM1ganglioside ［J］.J Neurosci Res，1984;12（2-3）:485-492.
［6］Merry DE，Korsmeyer SJ.Bcl-2gene family in the nervous sys-tem ［J］.Annu Rev Neurosci，1997;20 245-267.
［7］Tang QH，Wang H，Chen BQ，Cong YP，Shang GX，Lei F，Wang WY.Expression and significance of anti-apoptotic gene bcl-2in renal cell carcinoma ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（2）:141-145.
［8］Kluck RM，Bossy-Wetzel E，Green DR，Newmeyer DD.The release of cytochromec from mitochrodria:Aprimary site for Bcl-2regulation of apoptosis ［J］.Science，1997;275（5303）:1132-1136.
［9］Yang J，Liu X，Bhalla K，Kim CN，Ibrado AM，Cai J，Peng TI，Jones DP，Wang X.Prevention of apoptosis by Bcl-2:Re-lease of cytochromrc from mitochrondria blocked ［J］.Science，1997;275（5303）:1129-1132.
［10］ Leist M，Nicotera P.Apoptosis，excitotoxicity，and neu-ropathology ［J］.Exp Cell Res，1998;239（2）:183-201.
［11］Karpiak SE，Wakade CG，Tagliavia A，Mahadik SP.Temporal changes in edema，Na+，K+，and Ca2+ in focal cortical stroke:GM1ganglioside reduces ischemic injury ［J］.J Neu-rosci Res，1991;30（3）:512-520.
［12］Mahadik SP，Bharucha VA，Stadlin A，Ortiz A，Karpiak SE.Loss and recovery of activities of alpha+and alpha isozymes of Na+ K+ -ATPase in cortical focal ischemia:GM1ganglioside protects plasma membrane structure and function ［J］.J Neu-rosci Res，1992;32（2）:209-220.