作者：赵峰 戚好文 赵一玲 吕荣
【关键词】 肺纤维化
关键词: 肺纤维化;普伐他丁;博来霉素A5
摘 要:目的 观察氟伐他汀（fluvastatin）对博来霉素（bleomycinA5 ）所致的大鼠肺纤维化的治疗作用，为肺纤维化的治疗探索一种新的方法. 方法 雄性SD大鼠30只，随机分为正常对照组（C组）、博来霉素组（B组）及根据给博来霉素后第1，15日始每日按20mg kg-1 及10mg kg-1 给予氟伐他汀灌胃治疗分为4个治疗组（TH 1，TL 1，TH 15及TL 15组）.28d后处死所有动物，提取肺组织，HE染色，显微镜下观察，Leica Q500MC图像分析系统测定肺泡间隔成纤维细胞数量、厚度及肺间质面积.Masson、苦味酸天狼猩红染色，观察基质胶原及Ⅰ，Ⅲ型胶原变化.肺组织匀浆测定羟脯氨酸含量，并比较各组间变化. 结果 ①B组的肺泡间隔成纤维细胞数量、厚度、肺间质面积及肺组织羟脯氨酸含量均高于C组（P&<0.01），各氟伐他汀治疗组的以上各观察指标均低于B组（P&<0.01或P&<0.05）.②肺泡间隔成纤维细胞数量、厚度、肺间质面积在TH 1组低于TH 15组（P&<0.01），TL 1组低于TL 15组（P&<0.01或P&<0.05）.③B组基质胶原及Ⅰ，Ⅲ型胶原分布较C组明显增多，各氟伐他汀治疗组均有不同程度的减少. 结论 氟伐他汀对博来霉素所致的大鼠肺纤维化具有明显治疗作用，且早期治疗较晚期治疗效果更为明显.
Keywords:pulmonary fibrosis;pravastatin;bleomycin A5
Abstract:AIM To investigate the therapeutic effect of flu-vastatin in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats.METHODS Thirty SD rats were pided into six groups:The normal control group（Group C），the model group treat-ed with bleomycinA5 （Group B）and the rest（Groups TH 1，TH 15，TL 1and TL 15）so named according to the dose of flu-vastatin which were20mg kg-1 and10mg kg-1 and the date which were the first and the fifteenth day after the rats were given bleomycinA5 respectively.All the rats were killed on the twenty-eighth day.The number of fibroblast and the thickness of alveolar wall，the area of mesenchyma in lung tissue were measured by HE staining.The extracellular ma-trix andⅠ，Ⅲtype collagen in lung tissue were observed by Masson and sirius red staining and hydroxyproline was mea-sured in lung tissue homogenates.RESULTS The number of fibroblast and the thickness of lung alveolar wall，the area of mesenchyma and the content of hydroxyproline in lung tis-sue were significantly higher in Group B than in Group C（P&<0.01）.The data in the treatment groups were lower than those in Group B（P&<0.01or P&<0.05）.It was also found that the data of HE staining were lower in Group TH 1than in Group TH 15（P&<0.01）and in Group TL 1than in Group TL 15（P&<0.01or P&<0.05）.In addition，the extracellular matrix andⅠ，Ⅲtype collagen in lung tissue were more in group B than in group C，and compared with group B，they were less in the treatment groups.CONCLUSION Fluvas-tatin might be a therapeutic medicine for pulmonary fibrosis.
0 引言
肺间质纤维化是多种病因引起的异质性A5 （heterogenous）疾病，其主要病理特点是早期的弥漫性肺泡炎和后期大量成纤维细胞的病理性增生及基质胶原进行性积聚并取代正常的肺组织结构［1］ .近年来其发病率有增高的趋势，且治疗效果差［2］ .氟伐他汀（fluvastatin）是一种完全人工合成的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，除可降低胆固醇外，还对成纤维细胞等多种细胞的增殖具有抑制作用［3，4］ ，但目前有关用氟伐他汀治疗肺纤维化的报道甚少.我们利用博来霉素A5 （bleomycinA5 ）建立大鼠肺纤维化模型［5］ ，观察氟伐他汀对肺纤维化的治疗效果.
1 材料和方法
1.1 材料 氟伐他汀由北京诺华制药有限公司提供（批号:20000091）;博来霉素A5 由天津太河制药有限公司提供（批号:001014）;雄性SD大鼠30只，由第四军医大学实验动物中心提供，体质量200～250g.
1.2 方法 动物随机分为6组:①博来霉素模型组（B组）5只，硫喷妥钠ip麻醉后，气管内一次性注入含博来霉素A5 的生理盐水约0.2～0.3mL（5mg kg-1 ），注射后立即将动物直立并旋转，使药液在肺内分布均匀;②氟伐他汀治疗组（T组）20只，模型制备同B组，根据模型制备后第1，15日始每分别给予氟伐他汀20mg kg-1 及10mg kg-1 灌胃分为TH 1，TL 1及TH 15，TL 15组，每组5只;③正常对照组（C组）5只，在同样条件下气管内注入等体积生理盐水.28d后处死所有动物，提取肺组织.自气管向大鼠左肺灌注40g L-1 甲醛溶液，使胸膜展平，将左肺浸入40g L-1 甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，切片（5μm），HE染色，显微镜下观察，Leica Q500MC图像分析系统测定肺泡间隔成纤维细胞数量、厚度及肺间质面积;Masson染色，观察基质胶原变化;苦味酸天狼猩红染色，偏振光显微镜下观察Ⅰ，Ⅲ型胶原变化.取大鼠右肺，按1g肺组织加5mL生理盐水比例制成匀浆，以氯氨T法［6］ 测定羟脯氨酸含量（A550nm 值）代表肺组织胶原含量.
统计学处理:所有计量结果用x ±s表示，两组间统计采用t检验.
2 结果
2.1 HE染色 C组大鼠无明显病变.B组大鼠肺泡腔明显变小，肺泡间隔增厚，肺间质增多，间质内可见大量成纤维细胞，巨噬细胞明显增多，部分可见大片肉芽组织.T组各组较B组肺泡间隔有不同程度的变薄，肺间质、成纤维细胞、巨噬细胞均有所减少，未见有大片肉芽组织.图像分析定量结果见Tab1.
表1 HE染色各组肺泡间隔成纤维细胞数量、厚度及间质面积变化 略
2.2 Masson染色 C组淡蓝色的基质胶原较少，主要分布在大气道及血管壁周围.B组基质胶原明显增多，尤以局部肉芽组织处更为明显.T组各组较B组有不同程度的减少（Fig1，2）.
2.3 苦味酸天狼猩红染色 在偏振光下观察，可见Ⅰ型胶原纤维呈现粗大的黄色、桔红色，Ⅲ型胶原纤维呈现纤细的绿色，二者相伴分布.C组主要分布在气道壁、血管壁及其周围.B组除此以外在各部位均有分布，并在局部肉芽组织中分布较多.T组各组较B组有不同程度的减少（Fig3，4）.
2.4 肺组织匀浆羟脯氨酸含量（A550nm 值） B组肺组织匀浆脯氨酸含量（0.318±0.029）较C组（0.194±0.022）有明显增加（P&<0.01）.氟伐他汀治疗后，TH 1组（0.230±0.034）、TL 1组（0.246±0.029）、TH 15组（0.269±0.026）及TL 15组（0.274±0.029）较B组均有不同程度的降低（P&<0.01或P&<0.05）.
3 讨论
多种肺部疾病在后期可引起不同程度的肺间质纤维化.研究［7］ 表明，许多炎性介质及细胞因子均可刺激肺成纤维细胞过度增生，基质胶原分泌增多，最终引起肺纤维化.博来霉素A5 复制的大鼠肺间质纤维化模型与人类肺间质纤维化病理过程相似，因此被国际上普遍采用.我们复制的模型经病理学检查呈现典型的肺纤维化改变，表明模型复制成功.在博来霉素A5 复制的大鼠肺间质纤维化模型中，早期主要为以肺泡巨噬细胞、中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，并有大量转化生长因子β1 （TGFβ1 ）等炎性因子产生，约2wk后成纤维细胞大量增生，TGFβ1 等炎性因子逐渐减少［5，8，9］ ，因此，本实验分别于模型制备后第1，15日始给予氟伐他汀治疗，并参考林志鸿等［10］ 的方法给予20mg kg-1 和10mg kg-1 两种剂量治疗.研究结果显示氟伐他汀可有效减少肺间质纤维化大鼠的间质成纤维细胞数量和胶原含量，控制肺间质纤维化的发生和发展.
氟伐他汀是一种完全人工合成的HMG-CoA还原酶抑制剂，可抑制HMG-CoA转化为甲羟戊酸，阻断甲羟戊酸代谢途径，使甲羟戊酸及其衍生物这些提供细胞生长和增殖所必需的多种原料的合成均减少，因而对成纤维细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等多种细胞均具有强大的抗增殖作用［4，11］ ，并且此抑制作用已经在实验研究中成功地用于防治动脉粥样硬化［12，13］ .Tan等［14］ 在动物实验中发现另一种HMG-CoA还原酶抑制剂 洛伐他汀可促进由皮下异物所致的大量增生的成纤维细胞发生凋亡，进而减少成纤维细胞的增生，达到治疗目的，但目前有关氟伐他汀对肺纤维化的作用的报道甚少.肺纤维化的主要病理特点是后期大量成纤维细胞的病理性增生及基质胶原的增多，我们观察了不同给药时间、不同剂量的氟伐他汀对肺纤维化大鼠的影响，发现早期给药较晚期给药的治疗效果更加明显，但未发现两种治疗剂量的治疗效果有统计学差异，考虑在较低剂量时大鼠吸收的氟伐他汀已有效抑制了甲羟戊酸及其衍生物的合成，从而抑制了成纤维细胞的增生.
TGFβ1 可促进成纤维细胞增殖及分泌胶原，在肺间质纤维化的发展过程中起着重要作用［15，16］ .氟伐他汀就是通过抑制肾皮质TGFβ1 的表达而达到对肾小球硬化的治疗作用［17］ .在肺间质纤维化的治疗中，氟伐他汀是否通过对TGFβ1 的影响进而抑制成纤维细胞的增殖及细胞外基质蛋白的沉积尚待深入研究.
参考文献
［1］Agostini C，Siviero M，Semenzato G.Immune effector cells in idiopathic pulmonary fibrosis ［Review］［J］.Curr Opin Pulm Med，1997;3（5）:348-355.
［2］Mason RJ，Schwarz MI，Hunninghake GW，Musson RA.Phar-macological therapy for idiopathic pulmonary fibrosis.Past，pre-sent，and future ［Review］［J］.Am J Respir Crit Care Med，1999;160（5）:1771-1777.
［3］Corsini A.Fluvastatin:Effects beyond cholesterol lowering ［re-view］［J］.J Cardiovasc Pharmacol Ther，2000;5（3）:161-175.
［4］Negre-Aminou P，van Vliet AK，van Erck M，van Thiel GC，van Leeuwen RE，Cohen LH.Inhibition of proliferation of hu-man smooth muscle cells by various HMG-CoA reductase in-hibitors;Comparison with other human cell types ［J］.Biochim Biophys Acta，1997;1345（3）:259-268.
［5］Zhao HW，Peng L，Lu CJ，Hou XM，Yu RJ.Consecutive stud-ies on cell constitutes of bronchoalveolar lavage fluid and the pathological findings within the lung in bleomycin-induced pul-monary fibrosis in rats ［J］.Zhongguo Yike Daxue Xuebao（J Chin Med Univ），1997;26（5）:463-466.
［6］Lan H，Wang Z，Zhang LX，Guo SZ.Inhibition of Tetram-ethylpyrazine（TMP）on hypertrophic scar-derived fibroblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（11）:964-965.
［7］Lasky JA，Brody AR.Interstitial fibrosis and growth factors ［Review］［J］.Environ Health Perspect，2000;108（Suppl4）:751-762.
［8］Ma YW，Tong ZY，Hou XM，Kang J，Yu RJ.Quantitative analysis of TGF-β1 in different kind of cells in lung tissues of bleomycin-induced pulmonary fibrosis rats ［J］.Zhongguo Yike Daxue Xuebao（J Chin Med Univ），1998;27（5）:467-470.
［9］Nozaki Y，Liu T，Hatano K，Gharaee-Kermani M，Phan SH.Induction of telomerase activity in fibroblasts from bleomycin-in-jured lungs ［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2000;23（4）:460-465.
［10］Lin ZH，Xie LD，Wu KG，Wang HJ，XU CS.Effects of short-term fluvastatin treatment on the resistant vessel hypertrophy in spontaneously hypertensive rats ［J］.Gaoxueya Zazhi（Chin J Hypertension），1998;6（4）:307-310.
［11］Bellosta S，Ferri N，Arnaboldi L，Bernini F，Paoletti R，Corsini A.Pleiotropic effects of statins in atherosclerosis and diabetes ［J］.Diabetes Care，2000;23（Suppl2）:B72-B78.
［12］Buemi M，Allgra A，Senatore M，Marino D，Medici MA，Aloisi C，Di Pasquale G，Corica F.Pro-apoptotic effect of flu-vastatin on human smooth muscle cells ［J］.Eur J Pharmacol，1999;370（2）:201-203.
［13］Corsini A，Pazzucconi F，Arnaboldi L，Pfister P，Fumagalli R，Paoletti R，Sirtori CR.Direct effects of statins on the vascular wall ［J］.J Cardiovasc Pharmacol，1998;31（5）:773-778.
［14］Tan A，Levrey H，Dahm C，Polunovsky VA，Rubins J，Bitter-man PB.Lovastatin induces fibroblast apoptosis in vitro and in vivo.A possible therapy for fibroproliferative disorders ［J］.Am J Respir Crit Care Med，1999;159（1）:220-227.
［15］Eickelberg O，Kohler E，Reichenberger F，Bertschin S，Woodtli T，Erne P，Perruchoud AP，Roth M.Extracellular matrix de-position by primary human lung fibroblasts in response to TGF-beta1and TGF-beta3［J］.Am J Physiol，1999;276（5Pt1）:L814-L824.
［16］Sime PJ，Xing Z，Graham FL，Csaky KG，Gauldie J.Aden-ovector-mediated gene transfer of active transforming growth factor-1induces prolonged severe fibrosis in rat lung ［J］.J Clin Invest，1997;100（4）:768-776.
［17］Wen H，Lin ST.Effect of fluvastatin on renal transrorming growth factorβ1 in diabetic rats ［J］.Zhonghua Shenzangbing za-zhi（Chin J Nephrol），1999;15（2）:86-90.