作者：王汝涛 熊晓云 刘莉 张峰 招明高 贾敏 李晨 梅其炳
【关键词】 阿魏酸乙酯
关键词: 阿魏酸;阿魏酸乙酯;血小板;钙离子
摘 要:目的 观察阿魏酸乙酯抗二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板聚集作用，及其对血小板细胞内钙波动的影响. 方法 在含有阿魏酸乙酯和阿魏酸的兔富含血小板血浆（PRP）中加入ADP诱导血小板的集聚，以200mL・L-1 聚乙二醇为对照，用TYXN-91智能血液凝集仪观察血小板聚集率，激光共聚焦显微镜观察血小板细胞聚集时细胞内钙离子的变化情况. 结果 不同终浓度（0.1，0.5，1.5和3.0mmol・L-1 ）的阿魏酸乙酯对ADP诱导的血小板聚集抑制百分数分别为（%）26.3±3.3，33.4±2.4，73.4±3.1和94.9±2.7，均显著高于等浓度的阿魏酸水平（n=8，P&<0.05）.在阿魏酸乙酯作用下ADP诱导的血小板细胞内钙离子荧光强度的变化（ΔFI）为4.6±1.7，明显低于对照值ΔFI（10.3±2.6）（n=8，P&<0.01）. 结论 阿魏酸乙酯抑制由ADP诱导的血小板聚集作用比阿魏酸强.
Keywords:ferulic acid;ethyl ferulate;blood platelets;cal
Abstract:AIM To investigate the inhibitory actions of ethyl ferulate on platelet congregate induced by ADP，and the ef-fect of platelet intracellular calcium oscillations.METHODS To observe platelet congregate rate induced by congregater TYXN-91.200mL・L-1 polyethylene glycol400as contral.Platelet intracellular calcium oscillation were observed by laser scanning.RESULTS Ethyl ferulate Inhibitions rate were（%）26.3±3.3，33.4±2.4，73.4±3.1and94.9±2.7，（n=8）at different concentration（0.1，0.5，1.5and3.0mmol・L-1 ），significantly increased than that of the group of ferulic acid，the change ofΔFI4.6±1.7is much lower than resting level10.3±2.6（n=8，P&<0.01）.CON┐CLUSION The inhibitive effect of Ethyl ferulate on platelet congregation induced by ADP was much more than that of ferulic acid.
0 引言
阿魏酸是多种中药的有效单体成分，具有多种药理作用［1，2］ .由于阿魏酸分子结构中的烷烃链较短，分子亲水性较强，难以通过生物膜发挥其抗凝血作用.我们从增加分子亲酯性考虑，在其烷烃链上增加酯键，合成了阿魏酸乙酯.初步验证其生物活性强于阿魏酸，进一步观察其对血小板细胞内钙离子浓度的影响，发现阿魏酸乙酯可抑制由ADP诱导的细胞内钙离子升高，进而抑制血小板的集聚.
1 材料和方法
1.1 材料 ①阿魏酸系上海化学试剂一厂产品;阿魏酸乙酯系第四军医大学药理学教研室提供;Flu-o3-AM:用美国分子探针公司生产的;二磷酸腺苷（ADP）购自美国Sigma公司.其他试剂均为国产分析纯试剂.②TYXN-91智能血液凝集仪为上海通用机电技术研究所生产;MRC-1024激光共聚焦系统为美国Bio-Rad公司生产.③新西兰兔8只，雌雄不拘，体质量（2.5±0.2）kg，第四军医大学动物中心提供.
1.2 方法
1.2.1 血小板血浆的制备和聚集性测定 将兔戊巴比妥钠ip麻醉后，颈动脉取血，按常规方法制备富含血小板血浆（PRP）和无血小板血浆（PPP）.阿魏酸和阿魏酸乙酯用200mL・L-1 聚乙二醇溶解，以200mL・L-1 聚乙二醇为空白对照，PPP调零点.准确吸取PRP0.45mL移入测定皿中，分别加入不同浓度的阿魏酸和阿魏酸乙酯0.05mL，37℃预温3min，加入诱导剂ADP终浓度为12μmoL・L-1 ，用血凝仪测定血小板聚集率.分别记录各组药物不同浓度作用下的血小板聚集曲线，以血小板聚集抑制百分数表示药物的作用强度，即:抑制百分数=对照皿聚集-给药皿聚集对照皿聚集 ×100%
1.2.2 激光扫描共聚焦显微镜观察血小板细胞内［Ca2+ ］波动 在培养皿底部钻一直径约1.5cm的孔，粘上一张超薄载玻片，形成一小皿.玻片用鼠尾胶包被，PRP做血小板计数后，取200μL，3000r・min-1 离心10min，去上清，加入10μmoL・L-1 Flu-o3-AM200μL，37℃孵浴40～50min，3000r・min-1 离心10min，去上清加入无钙的HEPES缓冲液200μL吹打使其悬浮，加100μL悬浮液在两个预制的培养皿中，各加入含1mmoL・L-1 Ca2+ 的HEPES缓冲液50μL，分别加入终浓度为1mmoL・L-1 阿魏酸乙酯和等体积的200mL・L-1 聚乙二醇400，在37℃预热3min，最后加入终浓度12μmol・L-1 的ADP，在激光扫描共聚焦显微镜下观察单位面积内血小板的钙荧光波动情况.
统计学处理:采用SPSS统计学软件包，进行团体t检验.
2 结果
2.1 阿魏酸乙酯及阿魏酸对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用 阿魏酸乙酯及阿魏酸在终浓度为1mmoL・L-1 时，对ADP诱导的血小板聚集具有抑制作用（Fig1）.阿魏酸乙酯组血小板聚集百分数为76.4%，阿魏酸组为57.2%，且聚集潜伏期延缓也更加明显.这说明阿魏酸乙酯抑制ADP诱导的血小板聚集作用较阿魏酸强.进一步观察不同终浓度的阿魏酸乙酯及阿魏酸，药物的终浓度分别为（0.1，0.5，1.5和3.0mmoL・L-1 ），阿魏酸乙酯组抑制百分数分别为（26.3±3.3，33.4±2.4，73.4±3.1，94.9±2.7）均显著高于等浓度的阿魏酸组（14.7±1.3，21.7±2.1，59.6±2.7，82.3±3.2）（n=8，P&<0.05，Fig2），且呈量效关系.
图1 － 图2 略
3 讨论
阿魏酸存在于多种药用植物中，近年来对其药理作用进行了广泛的研究.发现其在抑制血栓形成及调节免疫系统方面具有多方面的药理活性.阿魏酸抗血小板聚集作用的有效基团是酚羟基和苯环侧链上的取代烷烃基［3］ ，并且其药效与酚羟基数目的多寡和取代烷烃链的位置及长短有直接的关系［4］ .由于阿魏酸分子结构中的烷烃链较短分子亲水性较强，难以通过生物膜发挥其抗凝血作用.因此，改变其生物膜酯质层的物理状态，如膜的功能及膜的流动性可有效的提高其药理作用［5］ ，本研究通过对阿魏酸进行酯化改造增加其酯溶性，使其通过生物膜的能力增强，达到增强生物活性的目的.对比其与阿魏酸抑制由ADP诱导的血小板聚集的作用，我们发现其作用强于阿魏酸.
图3 － 图4 略
进一步研究阿魏酸乙酯抗血小板聚集的作用机制.结果表明，阿魏酸乙酯可明显抑制细胞内钙水平的升高，进而抑制血小板细胞聚集.且呈现出剂量依赖性，即随药物剂量的增加而抑制聚集百分数增大.二磷酸腺苷可以通过打开血小板细胞上的钙离子通道引发胞外钙离子的内流，同时也可以激活磷酯酶C，产生三磷酸肌苷（IP）促使胞内的致密管系统释放钙离子，导致［Ca2+ ］升高.细胞外钙离子进入细胞内或细胞内钙库释放钙离子都可以引发钙波动，表现为胞质内钙离浓度的变化，最终引发相应的生物行为［6］ .因此，阿魏酸乙酯抑制ADP诱导的血小板聚集的机制可能是抑制细胞膜上的［Ca2+ ］通道，使［Ca2+ ］内流受阻，即通过抑制钙离子的内流达到抑制血小板聚集的作用.另一方面在胞质中抑制磷酯酶C，导致胞内的致密管系统释放钙离子减少，从而导致胞内［Ca2+ ］降低.阿魏酸乙酯具有预期的生物学活性，为我们进一步合成阿魏酸丙酯和阿魏酸丁酯提供了理论依据.
参考文献
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