作者：马焰 孙月芬 高伟 周长满
【关键词】 细胞低氧
关键词: 成纤维细胞生长因子，碱性;肌，骨骼/细胞学;细胞低氧;基因，Bc1-2
摘 要:目的 观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对缺氧复氧（A/R）损伤后肌细胞凋亡（apoptosis）相关基因蛋白Bc1-2表达的影响. 方法 将培养的骨骼肌细胞分为正常对照组、A/R组及浓度分别为10，20和40μg L-1 的bFGF预处理加A/R组共5组，然后用免疫组化方法（ABC法）进行染色，统计分析Bc1-2阳性的肌细胞百分率、平均吸光度的变化. 结果 经bFGF预处理后，Bc1-2阳性的肌细胞百分率（如bFGF20μg L-1 组与对照组相比，23.3%→34.7%，P&<0.01）、平均吸光度（如bFGF20μg L-1 组与对照组相比，0.13→0.20，P&<0.01）均显著增加. 结论 bFGF对A/R损伤的骨骼肌细胞的凋亡可能具有抑制作用.
Keywords:fibroblast growth factor，basic;muscle，skeletal/cytology;cell hypoxia;genes，Bcl-2
Abstract:AIM To observe the Bcl-2expression on the cul-tured skeletal muscle cells in neonatal rats injuried by anoxia/reoxygenation（A/R）and preconditioned by basic fibroblast growth factor（bFGF）.METHODS We pided cultured skeletomyocytes into five groups，including control group，anoxia/reoxygenation（A/R）group，bFGF preconditioned with A/R groups（bFGF density was10，20，40μg L-1 re-spectively）.Then we used immunohistochemical method（ABC method）to dye culture skeletomyocytes.RESULTS Being preconditioned by bFGF，Bcl-2positive skeletom-yocytes’percentage rose（such as bFGF20μg L-1 group compared to control group，23.3%→34.7%，P&<0.01）and average light density increased（such as bFGF20μg L-1 group compared to control group，0.13→0.20，P&<0.01）.CONCLUSION bFGF probably inhibits the occurrence of apoptosis of cultured skeletomyocytes injuried by A/R.
0 引言
我们应用培养的新生大鼠骨骼肌细胞缺氧复氧（anoxia/reoxygenation，A/R）损伤模型，观察成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）对A/R损伤后骨骼肌细胞内抑制细胞凋亡的基因蛋白Bc1-2的表达，研究其对肌细胞凋亡的影响，以探讨bFGF作为药物预处理，保护骨骼肌细胞的可行性.
1 材料和方法
1.1 材料 出生3d内的Wistar大鼠60只（由军事医学科学院动物所提供），胰蛋白酶、DMEM培养基（Gibco公司，美国），100mL L-1 CO2 恒温孵箱，bFGF（由北京双鹭生物技术有限公司提供），0.2m2 的恒温（37℃）密闭容器，900mL L-1 N2 ，100mL L-1 CO2 ，抗Bc1-2抗血清、Ni-DAB葡萄糖氧化酶系统（购自北京中山生物技术公司），CMIAS图像分析仪（北京航空航天大学研制）.
1.2 方法 无菌取出生3d内的Wistar大鼠后肢肌肉，剪碎后经胰蛋白酶消化分离，置于含100mL L-1 胎牛血清的DMEM培养基中，于100mL L-1 CO2 孵箱培养，用差速贴壁法去除非成肌细胞.观察至卫星细胞（satellite cell，SC）发育成成肌细胞（myoblast）（约2.5d）时，以1×108 L-1 细胞密度转种于内置盖玻片，用多聚赖氨酸包被的12孔培养板，培养24h后换无血清培养液.实验分为5组，Ⅰ组为正常对照组;Ⅱ组为A/R组，给予等量磷酸盐缓冲液（PBS）;Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ组为bFGF干预组，A/R前分别在无血清培养液中加入不同浓度（10，20及40μg L-1 ）的bFGF.用无血清培养基孵育12h以后，A/R组及Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ组，同时移至0.2m2 的恒温（37℃）密闭容器内，连续充以无氧气体（900mL L-1 N2 ，100mL L-1 CO2 ），流速为200mL min-1 ，6h后取出，再置含900mL L-1 空气，100mL L-1 CO2 的培养箱内复氧12h.Ⅰ组，培养板持续置于孵箱内培育.实验结束后，细胞用40g L-1 多聚甲醛固定，抗Bc1-2抗血清按1 200倍稀释，按ABC法对各组细胞进行免疫组化染色，用Ni-DAB葡萄糖氧化酶系统显色，光镜下棕黄色为Bc1-2阳性细胞.100倍光镜下计数30个相邻视野中 Bc1-2免疫反应阳性细胞（棕黄色为Bc1-2阳性细胞）占总细胞数百分比，并作显微照相，在CMIAS图像分析仪上用吸光度组件对Bc1-2免疫反应阳性细胞作平均吸光度的色谱分析.
统计学处理:实验数据用Excel软件处理，实验结果以x ±s表示，组间差异用t检验.
2 结果
Ⅰ组肌细胞对Bc1-2有一定表达（Fig1），Ⅱ组肌细胞表达很低（Fig2），而经bFGF预处理的A/R后的肌细胞Bc1-2免疫反应增强（Fig3，4）.
图1 －图4 略
2.1 bFGF对A/R后Bc1┐2阳性肌细胞百分比的影响 Ⅰ组的肌细胞Bc1-2阳性的百分比为（23.3±4.2）%;Ⅱ组的肌细胞Bc1-2阳性的百分比为（14.3±3.3）%（与Ⅰ组比P&<0.01）;Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ组的肌细胞Bc1-2阳性的百分比分别为（23.6±5.9）%（与Ⅱ组比P&<0.01），（34.7±5.8）%（与Ⅲ组比P&<0.01），（40.8±4.2）%（与Ⅳ组比P&<0.05）.
2.2 bFGF对A/R后Bc1┐2阳性肌细胞平均吸光度的影响 Ⅰ组肌细胞对Bc1-2有一定表达（Fig1），A/R组肌细胞表达很低（Fig2），而经bFGF预处理的A/R后的肌细胞Bc1-2免疫反应增强（Fig3，4）.Ⅰ组的肌细胞平均吸光度为0.13±0.05;Ⅱ组的肌细胞平均吸光度为0.08±0.20（与Ⅰ组比P&<0.01）;Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ肌细胞平均吸光度分别为0.15±0.06（与Ⅱ组比P&<0.01），0.20±0.10（与Ⅲ组比P&<0.01）和0.25±0.05（与Ⅳ组比P&<0.05）.
Bc1-2最初是从人的滤泡性B淋巴细胞中分离出来的，定位于人第18号染色体，通过抵抗多种形式的细胞死亡而延长细胞寿命.Bc1-2原癌基因蛋白是位于线粒体膜或核膜及溶酶体膜的膜蛋白，其作用为抑制多种原因引起的细胞凋亡［1，2］ .有关Bc1-2基因家族在肌细胞中作用的研究，国外已有报道［3］ ，认为Bc1-2的高表达有助于维持肌细胞的存活，持续增加的Bc1-2高表达可对抗Bax促进凋亡的作用.Bc1-2还可作为反映有些癌症生物学行为和预后的重要标记物.我们研究结果表明，正常对照组Bc1-2的表达并不高，单纯A/R组Bc1-2表达呈低水平.
近期研究表明，骨骼肌细胞中不仅存在有bFGF特异性受体（FGFR），而且本身也合成和分泌bFGF.缺血缺氧，创伤等因素常导致骨骼肌内源性bFGF含量减少，而外源性bFGF有助于损伤、炎症组织的恢复及免疫调节［4-6］ .用bFGF预处理各组则呈现出浓度依赖性的Bc1-2高表达，与A/R组相比各组均有显著性差异（P&<0.01）.与正常对照组相比，bFGF20μg L-1 +A/R组及bFGF40μg L-1 +A/R组有显著性差异（P&<0.01）.说明bFGF20μg L-1 以上有显著作用.单纯A/R组肌细胞Bc1-2表达较正常对照组下调，表明骨骼肌细胞缺氧复氧受损后除可引起肌细胞坏死外，尚可诱导肌细胞凋亡［7，8］ ，而bFGF可明显上调A/R肌细胞Bc1-2表达，抑制肌细胞凋亡.bFGF对A/R细胞保护作用的机制，可能为bFGF与肌细胞膜上高亲和力FGF受体（FGFR）结 合形成二聚体激活物，激活了细胞内的酪氨酸蛋白激酶（PKC），通过PKC介导的一系列复杂的生化过程影响多种基因转录，抑制凋亡基因的转录表达，诱导或激活凋亡抑制基因，如bc1-2基因等的表达，从而抑制细胞凋亡.
参考文献
［1］Qin RF，Gu XM，Qin XC.Apoptosis in proliferation and differ-entiation of skeletal muscle cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（1）:20-22.
［2］Ding AS，Wang FZ，Fu QW，Chang M，Fan M.Effects of rhil-6on on bcl-2experssion of rat hippocampal neurons after anoxia ［J ］.Zhongguo Yinyong Senglixue Zazhi（Chin J Appl Physiol），1999;15（3）:197-200.
［3］Deng ZH，Huang WG，Jin Y，Qir JH，Wang JL.Distribution and function of the members of bFGF and vascular endothelial growth factor in laryngeal mueosa ［J］.Di-si Junyi Daxue Xue-bao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（1）:70-72.
［4］Fu XB，Yang YH，LI XK.Ischemia and reperfusion impair the gene expression of endogenous basic fibroblast growth factor（bFGF）in rat skeletal muscles ［J］.J Surg Res，1998;80:88-90.
［5］Tian T，Wu ZH，Jin HM.Apoptosis in atrophic skeletal muscle induced by brachial plexus injury in rats ［J］.Zhonghua Yixue Zazhi（Natl Med J China），2000;80:530.
［6］Yan RL，Wang JP，Hui HX，Zheng WG.Immunohistochemical analysis of anti-apoptotic gene Bcl-2expression in ovary cancer ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1997;18（2）:142-145.
［7］Feng Y，Duan ZQ，Hu HD，Lu YJ，Pei QS.The relation-ship between apoptosis related-gene expression and proliferative ac-tivety in smooth musule cell after autogenous vein grafting ［J］.Zhonghua Yixue Zazhi（Natl Med J China），1999;79（1）:15-18.
［8］Xue PL，Hu JL，Wang JB.Bcl-2and bax expression are possi-ble prediction about the developing of patients who are suffering large intestinal cancer ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1997;18（5）:479-480.转贴于