作者：刘贺亮 崔大祥 王禾 陈宝琦 邵国兴 严泉剑
【关键词】 肾肿瘤
关键词: 原癌基因蛋白质p21（ras）;转染;脱噬作用;肾肿瘤;肿瘤细胞，培养的
摘 要:目的 探讨p21WAF1/CIP1 基因在顺铂诱导的GRC-1肾癌细胞凋亡过程中的作用. 方法 使用脂质体转染方法将正义p21WAF1/CIP1 基因及反义p21WAF1/CIP1 基因分别导入GRC-1肾癌细胞系中，对所获转染细胞进行形态学观察和流式细胞仪检测. 结果 在正义p21WAF1/CIP1 基因转染后GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导细胞凋亡的作用增强;在反义p21WAF1/CIP1 基因转染后GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导细胞凋亡的作用受到抑制. 结论 在GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导的细胞凋亡至少部分是通过p21WAF1/CIP1 基因发挥作用.p21WAF1/CIP1 基因作为一个与细胞凋亡的相关基因可能参与肾癌细胞凋亡的调控.
Keywords:proto-oncogene protein p21（ras）;transfection;apoptosis;kidney neoplasms;tumor cells，cul-tured
Abstract:AIM To explore effect of p21WAF1/CIP1 gene on GRC-1renal carcinoma cell apoptosis mediated by Cisplatin.METHODS p21WAF1/CIP1 and antisense p21WAF1/CIP1 were re-spectively transfected into GRC-1renal carcinoma cell line by using lipofectin method.The observation of morphology and the detection of flow cytometer were made on transfected GRC-1cells.RESULTS Apoptosis mediated by Cisplatin were reinforced on p21WAF1/CIP1 gene transfected GRC-1cells，but were inhibited on antisense p21WAF1/CIP1 gene transfected GRC-1cells.CONCLUSION p21WAF1/CIP1gene at least part-ly produces a marked effect on apoptosis mediated by Cis-platin.p21WAF1/CIP1 ，as a gene closely related to apoptosis，might modulate the death or survivorship of renal carcinoma cell.
0 引言
近年来研究1-5］ 发现抑癌基因p21WAF1/CIP1 作为一种细胞周期负性调控因子，参与了细胞凋亡的活动，体外转染p21WAF1/CIP1 基因可以抑制多种肿瘤细胞的生长.同时，相关研究［5-7］ 还表明p21WAF1/CIP1 基因在肿瘤的发病机制中可能起着重要的作用.因此，在肾癌细胞中研究p21WAF1/CIP1 基因的作用很有必要.我们将正义p21WAF1/CIP1 基因及反义p21WAF1/CIP1 基因分别转染至GRC-1肾癌细胞后，用顺铂诱导建立肾癌细胞凋亡模型，通过对这两种凋亡模型和原代细胞凋亡模型进行比较，探讨p21WAF1/CIP1 基因在肾癌细胞凋亡过程中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 WAF1全长cDNA2100bp连接于PCEP4逆转录病毒表达载体NotⅠ与HindⅢ位点之间（由EL-Deiny等构建，第四军医大学基因所崔大祥博士惠赠）.GRC-1肾癌细胞由北京医科大学泌尿外科研究所提供，常规培养于含100mL・L-1 灭活小牛血清的1640培养液.p21mAb（中山公司）.流式细胞仪、透射电镜由第四军医大学中心实验室提供.
1.2 方法
1.2.1 反义p21WAF1/CIP1 质粒的构建和提取 PCEP4-p21WAF1/CIP1 质粒经NotⅠ，HindⅢ双酶切反应后回收PCEP4和WAF1两个片段，加入T4连接酶缓冲液、ATP，T4DNA连接酶，15℃过夜.将重新连接的质粒DNA行大肠杆菌XL1-Blue转化实验，随机挑选数个单菌落，扩增，提取质粒DNA，质粒DNA纯化后，行XhoⅠ+EcoRⅠ酶切反应，10g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，根据片段大小挑选出PCEP-WAF1-antisense质粒.
1.2.2 基因转染 使用脂质体Lipofectamin TM reagent（Gibco），按操作说明书将PCEP-WAF1和PCEP-WAF1-antisense分别转染至GRC-1肾癌细胞.转染后细胞在含有G418（500mg・L-1 ）和潮霉素（250mg・L-1 ）的RPMI1640培养液中筛选后继续传代培养至第10代.将原代细胞及转染后筛选、培养的第10代细胞加入20μmol・L-1 顺铂，分别建立凋亡模型.
1.2.3 p21蛋白表达检测 收集各组转染基因后肾癌细胞及原代细胞，用免疫荧光方法按文献［8］操作对细胞进行FITC标记，流式细胞仪分析定量分析p21蛋白表达FITC荧光强度.
1.2.4 形态学观察 ①光镜观察:取出培养瓶中带有各组GRC-1肾癌细胞的盖玻片，950mL・L-1 乙醇固定30min，晾干，常规HE染色，显微镜下观察.②透射电镜观察:收集冲洗细胞，1000r・min-1 离心5min，沿管壁缓慢加入30g・L-1 戊二醛固定，四氧化锇后固定，常规电镜脱水，包埋，超薄切片，染色，电镜观察.
1.2.5 流式细胞仪检测 收集各组转染基因后第10代细胞及原代细胞，分别予以10μmol・L-1 ，20μmol・L-1 和40μmol・L-1 处理，使用流式细胞仪进行分析.
统计学处理:实验结果使用χ2 检验.
2 结果
2.1 顺铂诱导原代细胞凋亡 原代细胞顺铂作用1h后，在浓度大于20μmol・L-1 各组细胞均可见部分细胞逐渐分离，细胞变小，细胞离壁上浮，并随时间延长、顺铂浓度升高而增多.12h后，在20μmol・L-1 和40μmol・L-1 组原代细胞HE染色均可见细胞边集，核膜皱缩现象.透射电镜观察可见肾癌细胞体积明显缩小，胞内结构密度增加，聚集成块的染色质在核膜下边集，并见凋亡小体.
2.2 p21基因转染对细胞凋亡的影响 转染正义p21WAF1/CIP1 基因后未经任何处理的细胞早期有脱壁现象，电镜可观察到有凋亡小体出现，将第10代细胞加入20μmol・L-1 顺铂处理后，细胞早期同样出现脱壁现象，透射电镜观察可见凋亡小体.转染反义p21WAF1/CIP1 基因后未经任何处理的细胞早期无细胞 凋亡现象出现，第10代细胞加入40μmol・L-1 顺铂处理后，细胞才出现脱壁现象，使用透射电镜可观察到少量凋亡小体（Fig1）.
2.3 p21蛋白表达检测 流式细胞仪检测肾癌细胞FITC荧光强度的结果显示转染正义p21WAF1/CIP1 基因的肾癌细胞FITC染色率为90.6%，转染反义p21WAF1/CIP1 基因的肾癌细胞FITC染色率为1.4%，原代细胞FITC染色率为21.6%，三者之间存在显著性差异（P&<0.01）.
图1 电镜下观察转染反义p21 略
2.4 流式细胞仪检测结果 顺铂诱导原代细胞凋亡时，在20和40μmol・L-1 组均发生凋亡改变，流式细胞仪均显示有凋亡峰，在20μmol・L-1 浓度时，凋亡细胞占细胞总数的29.4%.转染正义p21WAF1/CIP1 基因的第10代细胞加入20μmol・L-1 顺铂处理后，凋亡细胞占细胞总数的75.6%.转染反义p21WAF1/CIP1 基因的第10代肾癌细胞仅在加入40μmol・L-1 顺铂处理后，流式细胞仪才显示有凋亡峰存在，此时凋亡细胞占细胞总数的15.1%.经χ2 检验分析表明，在使用20μmol・L-1 顺铂诱导凋亡后，原代细胞与两种转染基因细胞的凋亡细胞率间的差异有显著性（P&<0.01）.
肿瘤细胞是由于自身程序性生长、分化、死亡过程被阻断，而具有不死性的一种细胞，对肿瘤细胞凋亡加以激发和抑制，可能是防治肿瘤的新方法［9，10］ .p21基因是近年来研究发现的一种抑癌基因，p21基因编码的p21蛋白，能直接抑制细胞周期依赖激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）活性，负调控细胞周期，抑制细胞增殖，使细胞周期在G1 /S关卡处发生停滞，目前已证实抑癌基因的缺失或（和）突变是导致肾癌发生的重要原因［4，8］ .因此，研究并揭示p21基因在肾癌细胞凋亡过程中的作用可以为基因治疗肾癌的研究提供理论基础［11］ .
本实验中，原代细胞经顺铂作用1h后，原代细胞出现细胞凋亡现象即部分细胞逐渐分离，细胞变小，细胞离壁上浮，并有凋亡小体出现，随顺铂作用时间延长、浓度升高细胞凋亡现象更为明显.转染正义p21 WAF1/CIP1 基因后未经任何处理的肾癌细胞，早期即出现细胞凋亡现象，表明p21WAF1/CIP1 基因可促进肾癌细胞凋亡;而转染反义p21WAF1/CIP1 基因后未经任何处理的细胞并无细胞凋亡现象出现，并且传代培养的细胞与原代细胞相比需经较高浓度顺铂处理后细胞才出现细胞凋亡现象，光镜下可观察到脱壁现象，电镜可观察到有凋亡小体出现，这一现象可能说明反义p21WAF1/CIP1 基因可以抑制肾癌细胞凋亡.同时，流式细胞仪结果显示，原代细胞及两种转染基因肾癌细胞分别使用20μmol・L-1 顺铂处理时，原代细胞中的凋亡细胞占细胞总数的29.4%.转染正义p21WAF1/CIP1 基因的第10代肾癌细胞的凋亡细胞占细胞总数的75.6%.转染反义p21WAF1/CIP1 基因的第10代肾癌细胞中无凋亡细胞.三者相比较有显著性差异说明p21WAF1/CIP1 基因的活化是肾癌细胞凋亡过程中的一个重要环节，证实了p21基因编码的p21蛋白在肾癌细胞凋亡过程中的作用，对3组细胞p21蛋白表达检测结果进一步支持了上述结论.另外，转染反义p21WAF1/CIP1 基因的细胞经较高浓度顺铂处理后也出现细胞凋亡现象，是否表明存在引起肾癌细胞凋亡的多条途径，p21WAF1/CIP1 基因的活化仅为其中的一个途径，尚存在其他引起肾癌细胞凋亡的途径［12］ .我们认为p21蛋白或因p21WAF1/CIP1 表达而激活的下游基因产物可能真正决定着细胞是处于生长停滞或是走向死亡，由于目前我们缺乏足够的证据来证明［13，14］ ，所以有关这个问题尚需我们去进一步探讨研究.
通过本实验，可以帮助我们认识到在GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导的细胞凋亡至少部分是通过p21WAF1/CIP1 基因发挥作用.p21WAF1/CIP1 基因作为一个与细胞凋亡的相关基因可能参与了肾癌细胞凋亡的调控.
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