【关键词】 脑出血
关键词: 脑出血;炎性反应;炎性细胞因子
0 引言
炎性反应在缺血性脑血管病中的作用已有较多文献报道［1，2］ ，但脑出血后的相关研究则很少.为了提高脑出血的治愈率，明确脑出血的病理生理机制，我们用免疫组化方法对脑出血后不同时间出血灶周围的炎性反应，以及炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和6（IL-6）在脑出血后24h出血灶周围的表达进行研究.
1 材料和方法
1.1 材料 正常雄性SD大鼠8只，体质量230～250g，由第四军医大学实验动物中心提供.
图1 －图6 略
1.2 方法 ①动物随机分为实验组与对照组;②实验组4只，采用胶原酶注射制作尾壳核脑出血模型［3］ .将动物用10g・L-1 戊巴比妥钠（40mg・kg-1 ，ip）麻醉，固定于立体定向仪上，剃毛，无菌操作下在尾壳核部位定位（前囟尾侧0.8mm，矢状缝右侧3.5mm，深度5mm）注入胶原酶（Sigma公司生产）0.4U（2μL）和1μL肝素，10min内注完，留针10min后拔针，缝合皮肤.对照组4只，采用相同方法在尾壳核注入生理盐水3μL.术后观察动物24h，给予食物和水，注意其行为活动（包括摄食、活动量）的变化.注射后24h取材行免疫组化染色.给予10g・L-1 戊巴比妥钠（40mg・kg-1 ，ip）麻醉，后开胸，经心脏灌注，先用生理盐水100mL冲净血液，然后用预冷的40g・L-1 多聚甲醛（pH7.4）固定液500mL灌注，固定完毕，取出全脑，用40g・L-1 多聚甲醛后固定2h，再将脑放入200g・L-1 蔗糖溶液，4℃过夜.组织块完全沉底后挑选出血灶及其周围组织，用冰冻切片机连续冠状切片，片厚40μm;③采用免疫组织化学ABC法染色.先将切片经0.01mol・L-1 PBS漂洗5min×3次后，室温下浸入800mL・L-1 甲醇和3mL・L-1 过氧化氢封闭30min以消除内源性过氧化酶的影响，0.01mol・L-1 PBS漂洗5min×3次.接着用10g・L-1 牛血清白蛋白和30mL・L-1 正常羊血清在室温下分别孵育切片20min，以阻断组织与抗体的非特异性结合.最后室温下将切片浸入3mL・L-1 Triton X-100大约5min增加组织的通透性，以利于组织细胞内抗原的显示.ABC法如下:首先将切片浸入小鼠抗人IL-1β，IL-6和TNF-α液（1∶500，军事医学科学院基础所沈倍奋教授惠赠），室温36h;0.01mol・L-1 PBS漂洗10min×3次后入生物素化抗鼠IgG（1∶300，Vector公司，美国），室温3h;再用0.01mol・L-1 PBS漂洗10min×3次后最后入生物素化-卵白素-辣根过氧化物酶复合物（ABC，1∶200，NEB公司，美国），室温2h，0.01mol・L-1 PBS漂洗10min×3次.用硫酸镍铵DAB蓝色反应法进行呈色，当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应，贴片，脱水，透明，封片，BH-2光镜下观察;④对照组切片的免疫组织化学方法，一抗（小鼠抗人IL-1β，IL-6和TNF-α抗体）用牛血清白蛋白稀释液替代，二抗（生物素化的抗鼠IgG）和生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物与实验组相同，染色步骤也相同，结果没有细胞着色.
2 结果
脑出血后24h出血灶周围呈现明显的细胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6免疫反应阳性.TNF-α免疫阳性最为明显，为 ;IL-1β和IL-6则染色较淡，均为 .TNF-α和IL-1β阳性的细胞主要为星形胶质细胞，细胞形态小，突起多（Fig1，2），而IL-6免疫阳性的细胞则主要为神经元细胞和炎性细胞，包括单核细胞、巨噬细胞等（Fig5）.对照组仅有较少量的细胞因子表达或无表达（Fig3，4，6）. 3 讨论
脑出血急性期血清和脑脊液中炎性细胞因子水平均高于健康对照组，脑脊液中IL-1β和IL-6水平在出血后2～3d达高峰.IL-1β增强了炎性细胞和内皮细胞的粘附能力，介导了脑出血局部的炎症反应的发生［5］ .脑室内注入IL-1β和TNF-α均可加重脑水肿，二者使血脑屏障（BBB）破坏，通透性增加，引起脑细胞特别是星形胶质细胞的肿胀和变性，继而释放各种神经毒性因子加重BBB破坏和细胞膜损伤，产生和加重血管源性及细胞毒性脑水肿［6］ .另外，IL-1β是一种神经保护因子，IL-6是一种神经营养因子，二者的升高对于脑 出血的预后具有重要的意义.而且在临床上用IL-6水平可以早于CT预测脑出血患者脑损伤范围的大小［5］ .缺血性脑血管病时TNF-α升高，在早期其与缺血后局部白细胞的浸润有关，晚期则不仅与神经细胞的死亡有关，同时又可促进神经细胞表达神经生长因子［7］ .李光勤等［8］ 证实脑出血周围区存在明显的白细胞浸润，而且出血前给予强力霉素可明显减少血肿周围白细胞浸润及脑损害的程度和范围，提示白细胞浸润可能在脑血肿周围脑缺血的发生或（和）发展中起一定的作用.我们的结果从形态学角度证明了脑出血后24h病灶局部有明显的炎性细胞因子水平的增高，提示脑出血后24h抗炎性细胞因子的治疗对脑出血患者的预后有重要的意义，可为临床治疗提供理论依据.
参考文献
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