作者：徐磊 赵晏 史文春 王会生 薛荣亮
【关键词】 兴奋毒性
关键词: 谷氨酸;兴奋毒性;Bax;白细胞介素-2;小鼠;大脑皮层;海马
摘 要:目的 主要观察母鼠经口给予谷氨酸单钠ig对仔鼠大脑皮层和海马神经元Bax和Bcl-2表达的改变，探讨谷氨酸的兴奋毒性作用;并观察鼠大脑皮层和海马神经元Bax的改变与Bcl-2表达的改变是否有互动关系. 方法 妊娠17～21d的昆明系小鼠经口ig，给予谷氨酸单钠（4mg・g-1 ），仔鼠产后第10，20和30日采用免疫组织化学方法检测了Bax/Bcl-2在鼠脑皮层和海马组织中的表达.细胞损伤采用镜下细胞直接计数法. 结果 胚胎期摄入谷氨酸可引起10，20和30日龄仔鼠大脑皮层、海马CA1，CA2，CA3和CA4区神经元Bax表达的增高（d10.36.0vs16.6，47.0vs26.0，74.0vs25.0，34.3vs21.3，42.6vs22.0，P&<0.05;d20.27.0vs20.0，31.0vs9.7，52.3vs17.0，26.5vs10.0，63.7vs22.0，P&<0.05;d30.25.0vs9.7，32.0vs10.0，38.3vs14.7，26.0vs10.0，31.7vs9.7，P&<0.05，cells・0.0633mm-2 ），而相应地，10，20日龄仔鼠脑皮层和海马CA1，CA2，CA3和CA4区神经元Bcl-2的表达比正常鼠明显降低（d10.13.7vs44.7，12.0vs37.7，23.0vs61.7，11.0vs31.0，18.7vs51.7，P&<0.05;d20.14.0vs36.7，14.0vs32.7，19.0vs43.7，10.3vs27.3，19.3vs34.7，P&<0.05，cells・0.0633mm-2 ）;30日龄仔鼠脑皮层神经元Bcl-2的表达比正常鼠明显降低（23.3vs33.0，P&<0.05，cells・0.0633mm-2 ）. 结论 母鼠经口给予谷氨酸单钠ig可引起仔鼠大脑皮层和海马神经元Bax表达的增高和Bcl-2表达的降低.为临床应用Bcl-2治疗缺血性脑疾病提供了可能性.
Keywords:glutamate;excitotoxicity;Bax;Bcl-2;mouse;cerebral cortex;hippocampus
Abstract:AIM This study aimed at exploring excitotoxicity of monosodium glutamate（MSG）in the offspring cerebral cortex and hippocampal subregions after maternal MSG oral administration，and whether a change in Bax content was as-sociated with a response in Bcl-2expression.METHODS Kunming mice were given per os MSG（4mg・g-1 body weight）at17～21d of pregnancy and their offsprings′behav-ior was studied on postnatal days of10，20and30.By using immunohistochemical analysis，we examined the involvement of Bcl-2and Bax in the glutamate-induced cell death in corti-cal and hippocampal neurons.Cell damage was assessed by direct cell counting.RESULTS Administration of MSG dur-ing the fetal period in mice resulted in a moderate increase in the expression of Bax in principal neurons in the cerebral cor-tex，CA1，CA2，CA3，and CA4on postnatal days of10，20and30in the offspring mice（d10.36.0vs16.6，47.0vs26.0，74.0vs25.0，34.3vs21.3，42.6vs22.0，P&<0.05;d20.27.0vs20.0，31.0vs9.7，52.3vs17.0，26.5vs10.0，63.7vs22.0，P&<0.05;d30.25.0vs9.7，32.0vs10.0，38.3vs14.7，26.0vs10.0，31.7vs9.7，P&<0.05，cells・0.0633mm-2 ）.In contrast，Bcl-2protein expression was lowered significantly by glutamate exposure in principal neu-rons in the cerebral cortex，CA1，CA2，CA3，and CA4on postnatal days of10，20compared with that of the control（d10.13.7vs44.7，12.0vs37.7，23.0vs61.7，11.0vs31.0，18.7vs51.7，P&<0.05;d20.14.0vs36.7，14.0vs32.7，19.0vs43.7，10.3vs27.3，19.3vs34.7，P&<0.05，cells・0.0633mm-2 ）.Bcl-2protein expression was also low-ered significantly by glutamate exposure in principal neurons in the cerebral cortex on postnatal days of30（23.3vs33.0，P&<0.05，cells・0.0633mm-2 ）.CONCLUSION Maternal oral administration of MSG could increase the expression of Bax and decrease the expression of Bcl-2in cortical and hip-pocampal neurons in filial mice.These results indicate a pos-sible clinical role of Bcl-2in the treatment of ischemic brain disorders.
0 引言
大量谷氨酸（glutamate）有兴奋毒作用，并参与介导很多神经病变的细胞死亡［1］ .作为bcl-2族的原凋亡基因［2，3］ ，Bax也与神经元死亡过程有关［4］ .一般认为，兴奋毒性引起的神经元死亡为细胞坏死.而近来有证据表明细胞程序性死亡很可能参与了上述细胞死亡过程.我们参照以前的研究［5］ 应用谷氨酸单钠（monosodium glutamate，MSG）损伤模型对凋亡在神经兴奋毒性型细胞死亡的作用进行了研究.
1 材料和方法
1.1 材料 谷氨酸单钠购自浙江湖州生物化学制品厂.昆明系小鼠购自西安交通大学实验动物中心.小鼠喂以标准饲料和饮用自来水，环境温度为（23±1）℃.小鼠怀孕以出现阴栓为凭，胚胎第1日确定为小鼠交配后24h.母鼠产仔后20d与仔鼠分箱放置.仔鼠10，20和30日龄时ip内苯巴比妥麻醉，心腔内灌注0.01mol・L-1 PBS2min，预冷的40g・L-1 多聚甲醛固定液3min.取出鼠脑后放在4℃多聚甲醛固定液中4h，再置于4℃300g・L-1 蔗糖溶液中18～28h，使其沉底，去液，组织包埋剂附着，快速冷冻，-70℃保存.免疫组织化学检测的Bax和Bcl-2兔抗鼠抗体购自博士德生物制品有限公司.
1.2 方法 10，20和30日龄（d10，d20和d30）仔鼠脑在恒冷切片机上切成12～14μm厚度的组织冠状面切片，平铺于涂有硅化处理的载玻片上.每块组织切片周围涂上指甲油以防止液体流脱.切片室温下干燥30～45min，PBS浸泡30min，40g・L-1 多聚甲醛30min，PBS冲洗，正常羊血清封闭10min，1∶150一抗4℃过夜（16h），生物素化二抗37℃孵育50min，链酶亲和素生物素酶复合物37℃孵育40min.每一步孵育后均用PBS冲洗，最后一次PBS冲洗后加DAB显色8～10min，组织切片呈现深棕色反应，在PBS中浸15min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片.相邻之组织切片用正常兔血清或相应抗原抗体替代进行孵育.应用奥林巴斯光学显微镜进行观察和摄像，对组织冠状面的3个部位进行观察:头端，中部和尾端.各个切面组织轮廓定位以小鼠脑发育图谱为标准.
2 结果
2.1 Bax阳性神经元在小鼠脑中的分布 d10.在MSG损伤仔鼠脑皮层IVa，IVb层，海马CA1，CA2，CA3和CA4区，Bax呈高度表达（），而对照组相应地呈中度表达（）;在MSG损伤仔鼠脑皮层I～III，V层，Bax呈中度表达（），而对照组相应地呈低度表达（+）（Fig1）.
图1 小鼠脑皮层和海马神经细胞Bax的表达 略
d20.在MSG损伤仔鼠脑海马CA1，CA2和CA4区，Bax呈高度表达（），而对照组相应地呈低度表达（+）;在MSG损伤仔鼠脑皮层IVa，IVb层，海马CA3区，Bax呈中度表达（），而对照组相应地呈低度表达（+）.d30.在MSG损伤仔鼠脑皮层IVa，IVb层，海马CA1，CA2，CA3和CA4区，Bax呈中度表达（），而对照组相应地呈低度表达或缺省表达（+/±）;在MSG损伤仔鼠脑皮层I～III，V层，Bax呈低度表达（+），而对照组相应地呈低度表达或缺省表达（+/±，Tab1）.在d10，d20及d30，MSG损伤仔鼠脑皮层、海马CA1，CA2，CA3及CA4区Bax阳性表达的神经元数明显高于对照组（d10.36.0vs16.6，47.0vs26.0，74.0vs25.0，34.3vs21.3，42.6vs22.0，P&<0.05;d20.27.0vs20.0，31.0vs9.7，52.3vs17.0，26.5vs10.0，63.7vs22.0，P&<0.05;d30.25.0vs9.7，32.0vs10.0，38.3vs14.7，26.0vs10.0，31.7vs9.7，P&<0.05，cells・0.0633mm-2 ，n=6，Tab2）.
表1 小鼠大脑皮层和海马Bax阳性神经元的分布 略
表2 小鼠大脑皮层和海马Bax阳性神经元对比 略
2.2 Bcl┐2阳性神经元在小鼠脑中的分布 d10.在MSG损伤仔鼠脑皮层IVa，IVb层，海马CA1，CA2，CA3区，Bcl-2呈低度表达或缺省表达（+/±），而对照组相应地呈高度表达（）;在MSG损伤仔鼠脑皮层I～III，V层，海马CA4区，Bcl-2呈低度表达或缺省表达（+/±），而对照组相应地呈中度表达（）.d20.在MSG损伤仔鼠脑皮层IVa，IVb层，海马CA1，CA2和CA3区，Bcl-2呈低度表达或缺省表达（+/±），而对照组相应地呈中度表达（）.d30.在MSG损伤仔鼠脑皮层I～V层，海马CA1，CA2，CA3和CA4区，Bax呈低度表达（+），而对照组在皮层IV，V层，海马CA1，CA2，CA3，CA4区呈低度表达（+），在皮层I～III层缺省表达（-，Tab3）.在d10，d20，MSG损伤仔鼠脑皮层、海马CA1，CA2，CA3和CA4区Bcl-2阳性表达的神经元数明显低于对照组（d10.13.7vs44.7，12.0vs37.7，23.0vs61.7，11.0vs31.0，18.7vs51.7，P&<0.05;d20.14.0vs36.7，14.0vs32.7，19.0vs43.7，10.3vs27.3，19.3vs34.7，P&<0.05，cells・0.0633mm-2 ，n=6）.在d10，MSG损伤仔鼠脑皮层Bcl-2阳性表达的神经元数明显低于对照组（23.3vs33.0，P&<0.05，cells・0.0633mm-2 ，n=6，Tab4）.
3 讨论
谷氨酸既是一种神经递质，又可对神经元产生毒害.细胞间质中的谷氨酸水平调节对于防止谷氨酸兴奋毒性至关重要.NMDA谷氨酸受体介导的神经兴奋毒性细胞死亡是伴发损伤或疾病引起的广泛性脑损伤的重要原因.MSG可导致视网膜神经元的不可逆性坏死，在恒河猴妊娠晚期给予MSG可引起仔鼠下丘脑损伤.有些结果也提示，MSG可导致成熟和新生鼠脑神经元损伤以及记忆能力下降［6］ .在两种海马功能减退Wistar大鼠动物模型中发现，新生幼仔期给予MSG成年后海马CA1区锥体细胞发生特异性蜕变.即使接触谷氨酸的时间非常短暂，妊娠晚期给予MSG在光镜下也可发现脑室周围组织或下丘脑区产生急性和延迟性兴奋毒性表现.脑组织切片尼氏染色表明MSG摄入后未在海马区发现明显的细胞丢失.
表3 小鼠大脑皮层和海马Bcl-2阳性神经元的分布 略
表4 小鼠大脑皮层和海马Bcl-2阳性神经元对比 略
缺省Bax可持续抑制小脑颗粒细胞的靶细胞死亡［8］ .谷氨酸介导的神经元凋亡可能与Bcl-2族基因产物，如Bcl-2，Bcl-xL，Bax-alpha的调控有关.Bcl-2，Bcl-xL在谷氨酸作用24h时可下行调节，48h作用更甚.凋亡产物p21Bax-alpha在GB-12系细胞也发生下行调节，在GB-4系细胞作用较轻，在两种细胞系伴生p18Bax-alpha的变异型.上述发现提示，谷氨酸通过一种凋亡机制导致细胞死亡，其中可能有Bcl-2/Bax-alpha分子复合体的参与
［9］ .钙激活蛋白磷酸激酶也介导细胞凋亡钙离子引发的细胞凋亡机制由存在于细胞内的BAD磷酸化调节.左旋谷氨酸可引起钙离子内流，在海马神经元可引发靶线粒体内的BAD表达和细胞凋亡，而两者可被calcinerin显性抑制突变基因的共轭表达或这种磷酸激酶的抑制剂对抗［10］ .接触谷氨酸的小脑颗粒细胞在没有明显Bcl-2表达的情况下产生Bax mRNA和蛋白的快速增加，并引发细胞色素c从线粒体向胞质内释放［11］ .在脑发育早期皮层，海马Bcl-2弱表达表明MSG参与了神经元蜕变的发生.
致 谢 耿 燕、安 良、肖生祥、张磐建、曹振平、马韵琴、袁 媛和王青云的帮助和技术支持.
参考文献
［1］He YD，Fei Z，Zhang X，He XS，Li SH，Liang JW.Gene ex-pression of metabotropic glutamate receptor Ia after brain injury and efficacy of its antagonist MCPG ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（7）:612-615.
［2］Qiu XC，Zhang HZ，He DW，Yang LJ，Fan QY.Expression of bcl-2，bax and c-fos genes in the human osteosarcoma tissues ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（12）:S119.
［3］Tang QH，Wang H，Chen BQ，Cong YP，Shao GH，Lei F，Wang WY.Expression and significance of anti-apoptotic gene bcl-2in renal cell carcinoma ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（2）:141-145.
［4］Zhao YQ，Xiao B，Fan DM.Construction of human bax eukary-otic expression vector and its expression in human gastric cancer drug resistant SGC7901/UCR cell line ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（60）:468-471.
［5］Yu TX，Zhao Y，Shi WC，Ma RD，Yu LJ.Effects of maternal oral administration of monosodium glutamate at a late stage of pregnancy on developing mouse fetal brain ［J］.Brain Res，1997;747:195-206.
［6］Park CH，Choi SH，Piao Y，Lee YJ，Kim HS，Jeong SJ，RahJC，Seo JH，Lee JH，Chang K，Jung YJ，Suh YH.Glutamate and aspartate impair memory retention and damage hypothalamic neurons in adult mice ［J］.Toxicol Lett，2000;115（2）:117-125.
［7］Hsu C，Hsieh YL，Yang RC，Hsu HK.Blockage of N-methyl-D-aspartate receptors enhances postnatal neuronal apoptosis in rats ［J］.Neuroendocrinology，2000;71（5）:301-307.
［8］Selimi F，Vogel MW，Mariani J.Bax inactivation in lurcher mu-tants rescues cerebellar granule cells but not purkinje cells or in-ferior olivary neurons ［J］.J Neurosci，2000;20（14）:5339-5345.
［9］Nishi T，Takahashi M，Ito H，Yoshihama I，Takada E，Mizuguchi J.Participation of Bcl-2/Bax-alpha in glutamate-in-duced apoptosis of human glioblastoma cells ［J］.J Neurooncol，1999;44（2）:109-117.
［10］Wang HG，Pathan N，Ethell IM，Krajewski S，Yamaguchi Y，Shibasaki F，McKeon F，Bobo T，Franke TF，Reed JC.Ca2+ induced apoptosis through calcineurin dephosphorylation of BAD ［J］.Science，1999;284（5412）:339-343.
［11］Chen RW，Chuang DM.Long term lithium treatment suppress-es p53and Bax expression but increases Bcl-2expression.A prominent role in neuroprotection against excitotoxicity ［J］.J Biol Chem，1999;274（10）:6039-6042. 转贴于