关于苏拉明对体外培养视网膜色素上皮细胞增殖的影响

论文代写网： 　　　　　　作者：康军　惠延年　崔志利　韩泉洪


【关键词】 细胞培养
　　关键词: 色素上皮，眼;细胞培养;增殖;苏拉明;四甲基偶氮唑盐比色法;细胞分裂指数;AgNORs染色
　　摘 要:目的 研究苏拉明（suramin）对培养人视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）增殖的影响. 方法 将不同质量浓度的苏拉明（1.5，15和150mg・L-1 ）加入RPE细胞培养液，采用四甲基偶氮唑盐（tetrazolium，MTT）比色法，细胞分裂指数计数和核仁组成区嗜银染色（AgNORs）检测苏拉明对RPE增殖活力的影响. 结果 含有100mL・L-1 小牛血清的培养液可以显著刺激RPE的增殖（P&<0.01），无血清组A值为0.19±0.01、含血清组A值为0.30±0.01;苏拉明抑制了100mL・L-1 血清条件下RPE的增殖，呈剂量依赖性，最大抑制率达51%，3种浓度组A值分别为0.29±0.01，0.24±0.01和0.14±0.01，对细胞的形态无明显影响. 结论 苏拉明对血清刺激RPE增殖有显著非毒性抑制作用.　　
　　Keywords:pigment epithelium of eye;cell culture;prolifera-tion;suramin;MTT;cell pision index;Ag-NORs
　　
　　Abstract:AIM To investigate the effects of suramin on pro-liferation of cultured human retinal pigment epithelial（RPE）cells in vitro.METHODS The cultured human RPE cells were added with suramin（1.5，15，150mg・L-1 ）.Tetra-zolium colormetric assay（MTT），cell pision index and　AgNORs staining were performed to examine the cells viabili-ty of proliferation.RESULTS The serum stimulated RPE proliferation significantly（P&<0.01）.The serum-induced proliferation was effectively inhibited by suramin in a dose-dependent manner.The maximal inhibition rate was about51%.The A value was0.19±0.01and0.30±0.01in non-serum group and serum group respectively，and was0.29±0.01，0.24±0.01，and0.14±0.01at the concentrations of1.5，15，and150mg・L-1 suramin respectively.No abnor-mal cellular morphology was observed.CONCLUSION The serum-induced proliferation of RPE can be inhibited by suramin.
　　
　　0 引言
　　
　　增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo-retinopathy，PVR）是一种眼内细胞过度增生的病变，视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epitheli-um，RPE）是PVR中主要的增生细胞，因此，寻找有效的辅助药物，抑制RPE的增殖活性，对防止和降低PVR的发生具有重要的临床意义.我们用含有多种促生长物质的小牛血清作为促增殖因素，观察生长因子拮抗剂苏拉明在不同浓度时对RPE增殖的影响.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 人源第3代RPE4种作为实验细胞，由本院王雨生副教授惠赠.Delbecco改良的Eagle培养基（Delbeccon’s modified Eagle’s medium，DMEM）干粉（Gibco产品）、胰蛋白酶（Difco产品）、新生小牛血清（四季青产品）、苏拉明（suramin）（Alexis，Comerstone，USA）、四甲基偶氮唑盐（美国Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，上海化学制品厂）、硝酸银（河南焦作市化工三厂）、96孔细胞培养板（NUNC，Denmark）.
　　
　　1.2 方法 复苏RPE细胞，用含50mL・L-1 血清的DMEM培养液稀释，37℃，50mL・L1 CO2 孵箱静置培养，次日换液.细胞接近铺满时传代，选4～7代细胞用于实验.实验分空白对照组、对照组及实验组3组.空白对照组为无血清DMEM，对照组为含100mL・L-1 血清的DMEM，实验组为含有苏拉明（1.5，15和150mg・L-1 ）的100mL・L-1 血清的DMEM.
　　
　　1.2.1 MTT比色法 2.5mg・L-1 胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，接种于96孔板，约5×103 个细胞/孔，体积200μL/孔.培养12h后换液，每组设4个副孔.3d时，加入5g・L-1 MTT溶液20μL/孔，继续孵育4h，中止培养.加入二甲基亚砜（DM-SO）150μL/孔，振荡10min，使结晶物充分溶解.酶联免疫检测仪490nm波长下读取A值（Absorbance value）.重复实验3次.
　　
　　1.2.2 细胞分裂指数 将细胞悬液接种于放置有1.0cm×1.0cm小盖玻片的培养皿内培养，3d时取出盖玻片，40mg・L-1 多聚甲醛溶液固定30min，制备细胞铺片.HE染色，950～1000mL・L-1 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片.显微镜下观察细胞形态变化，取细胞数多、中、少3个视野，计数1000个细胞中细胞分裂像，计算所占比例.
　　
　　1.2.3 AgNORs染色 应用染色液的配制:配制20mg・L-1 明胶甲酸溶液.用去离子水配制500mg・L-1 硝酸银溶液，避光保存.染色前将前者与后者按1∶2比例，新鲜配制应用染色液.细胞铺片的制备同前.染色前去离子水浸泡、冲洗细胞铺片.将应用染色液滴加于细胞铺片上，室温避光染色1h，去离子水冲洗铺片，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片.显微镜下观察核仁形态，计数50个细胞的核仁数，并计算每个细胞核仁均数. 　　统计学处理:实验数据用x ±s表示，采用t检验检测各组之间的差别.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 MTT比色法 空白对照组A值为0.19±0.01，是对照组的64.0%，有显著差异（P&<0.01）.实验组1.5，15和150mg・L-1 组A值分别为0.29±0.01，0.24±0.01和0.14±0.01，是对照组的98.0%，81.0%和49.0%.苏拉明15和150mg・L-1 组与对照组相比有非常显著性差异（P&<0.01），1.5mg・L-1 组与对照组相比无明显差异（P&>0.05）.
　　
　　2.2 细胞分裂指数 HE染色见空白对照组细胞拉长，呈网状，细胞稀少.对照组细胞呈多边形，胞质粉红色，胞核为紫色，细胞生长密集，分裂像多.实验组细胞形态基本与对照组相似，周边可见少量胞体回缩呈圆形的细胞，着色较深，随着药物浓度的增加，细胞数量及分裂像减少（Fig1）.空白对照组细胞分裂指数为26‰，是对照组的60.5%，有显著差异（P&<0.01）.实验组苏拉明1.5，15和150mg・L-1 组细胞分裂指数分别为44‰，33‰和21‰，是对照组的102.0%，76.0%和44.2%.苏拉明15和150mg・L-1 组与对照组相比有非常显著性差异（P&<0.01），1.5mg・L-1 组与对照组相比无明显差异（P&>0.05）.
　　　　
　　图1 细胞分裂指数HE染色 略
　　
　　2.3 AgNORs染色 镜下观察，RPE胞质呈淡黄色或金黄色，胞核内AgNORs颗粒呈棕黑色或黑色，数量、大小及分布清晰可见.对照组细胞核AgNORs颗粒数目多在6～10个，平均为6.5个/细胞，总数为277个/50个细胞;空白对照组细胞核AgNORs颗粒数目多在2～4个，平均为3.5个/细胞，总数为174个/50个细胞，是对照组的62.8%（P&<0.01）;实验组苏拉明1.5，15和150mg・L-1 组细胞核AgNORs颗粒数目多在3～7，5～9和1～3个，每个细胞平均数分别为5.4，4.4和2.5个，每50个细胞核仁总数分别为269，226和127个，分别为对照组的97.1%（P&>0.05），81.5%（P&<0.01）和55.9%（P&<0.01）.
　　
　　3 讨论
　　
　　视网膜脱离、外伤或手术等因素刺激导致血眼屏障破坏时，从视网膜裂孔处进入玻璃体的RPE，在多种因子作用下趋化、增殖、产生胶原并牵拉收缩，最终导致牵拉性视网膜脱离.增加RPE的有丝分裂活性［2］ 可促进PVR的发生.苏拉明可竞争性地与细胞因子本身、配体或其细胞表面受体结合，干扰细胞因子的活性效应，阻止多种细胞因子刺激的肿瘤细胞的增殖，抑制促生长因子PDGF［3］ ，EGF，IGF等的活性.关于苏拉明诱导细胞调亡的实验报道亦有很多［4］ .而上述因素均在PVR的发生过程中起着重要作用.我们的实验通过3种不同的方法检测了血清及苏拉明对RPE的影响，MTT法可间接反映活细胞数量，检测细胞活力;细胞分裂指数可以表现细胞增殖的旺盛程度;AgNORs染色也是一个细胞增殖活性的指标，AgNORs颗粒的多少能反映细胞增殖能力的强弱.3种实验方法检测结果基本相近，都观察到苏拉明明显抑制了RPE的增殖，为进一步实验提供了较可靠的数据.我们观察到100mL・L-1 血清条件下RPE有旺盛的分裂增殖能力，表现为A值、细胞分裂指数和细胞核AgNORs颗粒数的显著增加，表明血清中的多种因子能有效刺激细胞分裂增殖，苏拉明剂量依赖性地抑制了血清的这种作用，最大抑制率达51.0%左右，在高浓度组抑制效应更加明显，且无细胞形态的明显变化，说明苏拉明抑制细胞增殖的能力并非毒性反应，根据苏拉明的作用特点，我们推测其可能的作用机制是:①苏拉明阻断了血清中的生长因子与其细胞表面受体的结合，抑制或中和了这些因子的效应，也可能降低了因子间的协同效应.②阻断了细胞的自分泌链，使细胞自分泌生长因子减少，活性降低.③抑制了对细胞有促进作用的酶类的活性效应，阻断了相关的信号传导途径.由于上述作用，间接诱导了细胞的调亡.但确切的作用机制，尚需进一步研究.
　　参考文献:
　　
　　［1］Hui YN.Proliferation vitreoretinopathy:Topic brought into the21st century ［J］.Zhonghua Yandibing Zazhi（Chin J Ocular Fundus Dis），1999;15（2）:67-68.
　　［2］Cao J，Zhang H，Liu N.The modulation of cell proliferation in-duced by growth factors in human retinal pigment epithelial cells ［J］.Zhonghua Yanke Zazhi（Chin J Ophthalmol），1997;33（5）:360-362.
　　［3］Hu Y，Zou Y，Dietrich H，Wick G，Xu Q.Inhibition of neointi-ma hyperplasia of mouse vein grafts by locally applied suramin ［J］.Circulation，1999;100（8）:861-868.
　　［4］Gill JS，Windebank AJ.Suramin induced ceramide accumulation leads to apoptotic cell death in dorsal root ganglion neurons ［J］.Cell Death Differ，1998;5（10）:876-883.