作者：张志培 江逊 黄立军 赵佐庆 施新猷 李六金 师长宏
【关键词】 肝癌细胞
关键词: SCID小鼠;免疫重建;肝癌细胞;免疫细胞
摘 要:目的 探讨SCID小鼠免疫重建及免疫对人肝癌细胞成瘤的影响. 方法 体外培养人肝癌细胞系，接种到SCID小鼠和用BALB/c，CBA/N小鼠外周血淋巴细胞重建的SCID（B-PBL-SCID和C-PBL-SCID）小鼠皮下;监测成瘤状态，测定鼠脾细胞毒杀伤力和免疫重建的免疫球蛋白量，作血清与靶细胞凝集实验. 结果 免疫重建体现了所用小鼠免疫对肿瘤的排斥特点，免疫重建成功;SCID和C-PBL-SCID小鼠100%成瘤（两瘤体相比P&<0.01），B-PBL-SCID出现瘤体后逐渐消失;B-PBL-SCID和C-PBL-SCID脾细胞对靶细胞有一定的杀伤力，B-PBL-SCID的血清能与靶细胞产生凝集反应. 结论 SCID是建立肿瘤模型和肿瘤免疫研究的良好动物;肝癌细胞在小鼠体内的成瘤率与T，B细胞免疫有关.
Keywords:SCID mice;immunoreconstitution;hepatocarci-noma cell;immune cell
Abstract:AIM To explore the immunoreconstitution of SCID mice and the affection of immunity on hepatocarcinoma cell growth in vivo.METHODS The human hepatocarci-noma cells cultured in vitro were inoculated into the limbs of SCID mice subcutaneously and the immunoreconstituted SCID mice with BALB/c and CBA/N mice peripheral blood lymphocytes（B-PBL-SCID and C-PBL-SCID mice）and their growth situations were monitored.The spleen cells of these mice were harvested in5weeks after inoculation and exam-ined for direct cytotoxicity to the hepatocarcinoma cells（tar-get cells）.The immunoglobulin concentration of B-PBL-SCID mice was surveyed and the serum agglutination of B-PBL-SCID mice was tested.RESULTS The successfully re-constituted immunity in SCID mice embodied the rejection characteristics of BALB/c and CBA/N mice to the hepatocar-cinoma cells.There was100%carcinoma growth in SCID and C-PBL-SCID mice，while the carcinoma of B-PBL-SCID mice disappeared after certain time.The spleen cells from B-PBL-SCID and C-PBL-SCID mice displayed certain cytotoxi-city to target cells，but the control group generated no lysis to target cells.The sera immunoglobulin of B-PBL-SCID mice had the level of g L-1 and generated agglutination with the target cells.CONCLUSION SCID is good for establish-ing tumor model and studying tumor immune.Carcinoma grows in the mice is correlated with T and B lymphcytes.
0 引言
SCID小鼠是一种严重联合免疫（T和B）细胞缺陷的突变系小鼠，缺乏细胞和体液免疫，对异源性移植物产生的排斥反应很小，有利于肿瘤和肿瘤免疫的研究.国外已较普遍利用SCID小鼠进行肿瘤免疫的研究［1］ ，国内也开张了一些研究［2］ ，但对免疫重建后的肿瘤免疫研究不够深入和具体.我们用BALB/c和CBA/N外周血淋巴细胞重建SCID（B-PBL-SCID和C-PBL-SCID）小鼠，将体外培养的人肝癌细胞接种到SCID，B-PBL-SCID和C-PBL-SCID小鼠的皮下，测定免疫重建后脾细胞毒力和B细胞产生的抗体水平，探讨SCID小鼠建立肝癌模型特点和免疫重建的免疫细胞与肿瘤生长之间的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞来源于实验动物中心建立的，经鉴定及100以上传代的人原发肝癌细胞系（HHCC-9724）［6］ ;用含100mL L-1 的小牛血清、10万U L-1 青霉素和10万U L-1 链霉素的RPMI1640完全培养液置于37℃，50mL L-1 CO2 孵箱中培养，传到一定数量的对数生长期时，用2.5mg L-1 的胰酶（含2mg L-1 的EDTA）消化、离心、调整细胞数后接种到小鼠.C.B-17SCID小鼠15只为解放军军事医学科学院动物中心提供的三级实验动物，体质量15～18g，5～8wk龄，用ELISA法检测无“渗漏”现象.全部实验小鼠都在无特定病原体（SPF）环境下饲养.BALB/c和CBA/N二级小鼠各5只用于重建SCID小鼠免疫.
1.2 方法 SCID小鼠分为3组，每组各为5只，其中2组用于免疫重建.
1.2.1 免疫重建及瘤体测量 在无菌条件下操作，摘除BALB/c和CBA/N小鼠眼球取血，常规Ficoll密度法分离淋巴细胞，获得的细胞用RPMI1640洗涤2次（1500 min-1 ×10），重新用RPMI1640悬浮，取一滴悬液与一滴2g L-1 台盼蓝染液混合，于计数板上计数活细胞［7，8］ ，调整细胞数到2×1010 L-1 ，于接种癌细胞3d前给SCID小鼠ip0.4mL.SCID小鼠在接种瘤细胞前分别称质量，各鼠接种癌细胞1wk后开始，每wk同一时间进SPF楼，观察肝癌生长情况，长出瘤体用游标卡尺测量，体积根据公式V=ab2 /2（a-短径，b-长径）计算，同时，SCID小鼠每wk称质量.5wk后处死，瘤体称质量.
1.2.2 SCID小鼠脾细胞毒杀伤功能检测 接种癌细胞的小鼠和相应正常鼠经脱颈处死，用750mL L-1 乙醇浸泡，在超净台中无菌取脾脏，研磨制成脾细胞悬液，洗涤后用100mL L-1 FCS RPMI1640调整1×1010 L-1 ，内加高剂量IL-2（10万U L-1 ）和经5Gy照射的肝癌细胞（1×109 L-1 ），加到24孔培养板中，于50mL L-1 CO2 孵箱中培养诱导5d.取对数生长期的癌细胞1×109 L-1 ，加N251 CrO4 3.7MBq于37℃孵育3h（每15min轻轻振摇1次），取出用100mL L-1 FCS RPMI1640洗涤3次（800r min-1 ，5min）重新悬浮，调整细胞数加入96孔培养板（每孔100μL含1×104 细胞），同时每孔加100μL不同浓度的效应细胞，每份3个复孔，效靶比例为100 1，50 1，25 1和12.5 1.最大释放组加入10g L-1 Triton X-100100μL，自然释放组加100μL的完全培养液，在37℃CO2 孵箱中培养4h.然后每孔取上清液100 μL，于γ计数仪上测定cpm值，计算:特异性杀伤率（%）=（实验释放 min-1 -自然释放 min-1 ）/（最大释放 min-1 -自然释放 min-1 ）.
1.2.3 测定特异性Ig抗体 包被兔抗鼠抗体加入ELISA板，100μL 孔-1 ，4℃过夜.取出板子，洗板3次（3×5min），10g L-1 小牛血清白蛋白液100μL封闭，37℃1h.取板，洗涤液洗板3次（3×5min），加入标准品、阴性对照及待测样品，37℃水浴箱1h.洗板3×5min，加入稀释好的酶标羊抗鼠抗体，37℃1h.洗板3×5min，加入显色液，室温10～15min，于EISA读数仪测的A值450nm，绘制标准曲线，算出检测样品含量.分离荷瘤小鼠和对照鼠血清;把肝癌靶细胞滴定到载玻片上，加入小鼠血清和对照组血清，观察其凝集反应结果，照相.
2 结果
2.1 皮下瘤变化 SCID小鼠成瘤率达100%，随时间推移而增大;两种免疫重建SCID小鼠有不同的瘤结节表现，B-PBL-SCID小鼠瘤结节到2wk后逐渐减小，5wk全部消失;C-PBL-SCID瘤结节3wk以后有逐渐缩小的趋势，但仍维持一定的大小（Fig1）.5wk末SCID和C-PBL-SCID瘤体结分别为（954±243）和（120±30）mm3 （P&<0.01）;本实验还有另一现象，SCID小鼠的体质量随瘤体积增大而减小，SCID小鼠瘤体和B-PBL-SCID的瘤体大小与其各自体质量存在着负线性关系前者r=-0.995，P&<0.01，后者r=-0.953，P&<0.05.C-PBL-SCID的皮下瘤体大小与其体质量没明显负线性差异，但也存在背离现象.
图1 SCID皮下瘤生长情况 略
2.2 荷瘤小鼠脾细胞对靶细胞杀伤力 在效靶比例100 1时有意义，C-PBL-SCID特异性杀伤率为（7.4±0.5）%，B-PBL-SCID为（6.4±0.6）%（自然释放率约为8.5%），SCID小鼠只有很小的杀伤作用（Fig2）.
2.3 Ig含量及与癌细胞的凝集反应 荷瘤B-PBL-SCID小鼠产生较高的Ig水平，达到g L-1 ，Ig逐渐升高，4～5wk基本趋向平稳（Fig3）.荷瘤B-PBL-SCID小鼠血清与癌细胞产生凝集反应，荷瘤SICD小鼠不与癌细胞产生凝集反应（Fig5，6）.
3 讨论
SCID小鼠体内未有功能性的淋巴细胞，血清中测不到抗体.根据这一特点，可将肿瘤植到SCID小鼠体内，建立肿瘤模型［6］ .我们将肝癌细胞接种到SCID小鼠，肿瘤生长速度快，瘤体结较大，与将肝癌细胞接种到裸鼠相比［7］ ，SCID小鼠显得更优越，是建立肿瘤模型更为理想的小鼠.SCID小鼠可进行免疫重建，我们用8×106 细胞数免疫重建的B-PBL-SCID和C-PBL-SCID没死亡，再现了两小鼠免疫对肝癌细胞排斥能力，免疫重建成功.但光镜下免疫重建的肝组织出现了炎症反应和肝细胞溶解，说明SCID小鼠仍能产生移植物抗宿主疾病（GVHD）.本实验GVHD较小，可能是用鼠源性淋巴细胞进行免疫重建，及与细胞数量不高于107 有关，如用人源性免疫细胞重建SCID就可能出现GVHD，所以用人免疫重建SCID小鼠时，要注意防止GVHD的发生.
图3－图6 略
肝癌细胞接种到各小鼠时，T，B细胞俱全的BALB/c小鼠免疫排斥肝癌细胞最强，CBA/N小鼠有较强的排斥力
［7，8］ .本研究B-PBL-SCID的瘤结节到3wk开始缩小，5wk全部消退，而C-PBL-SCID小鼠到5wk仍有缩小的瘤结节，也就是免疫重建的SCID小鼠再现了BALB/c和CBA/N小鼠排斥肝癌细胞的趋势:BALB/c排斥力大于CBA/N小鼠.免疫重建小鼠的脾细胞有一定的杀伤力，即免疫重建T细胞有排斥肿瘤的作用;C-PBL-SCID小鼠的脾细胞毒性大于B-PBL-SCID小鼠，表明，T细胞固然在抗肿瘤的作用中非常重要，但B淋巴细胞所产生的抗体以及B淋巴细胞对T细胞的促进作用是不可忽视的.
参考文献
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