关于鼠心肌成纤维细胞NOS活性的变化和AVP对NO合成的影响

作者：范延红　赵连友　王士雯　郑强荪　徐琳　杨学东　田建伟　张海涛

【关键词】 成纤维细胞
　　关键词: 心肌;成纤维细胞;一氧化氮合酶;一氧化氮;精氨酸升压素
　　
　　摘 要:目的 探讨在基础状态和精氨酸升压素（AVP）干预下，心肌成纤维细胞（CFs）一氧化氮合酶-一氧化氮（NOS-NO）系统活性的变化. 方法 胰酶消化法分离、培养新生SD大鼠CFs，采用硝酸还原酶法和分光光度法分别测定基础状态和AVP干预下CFs的NOS活性和NO含量. 结果 ①基础状态下CFs的36h组NO含量（42±5）μmol L-1 和NOS活性（617±83）μkat L-1 ，显著高于6h组（14±3）μmol L-1 ，（167±67）μkat L-1 .②AVP干预下36h组NO含量（62±1）μmol L-1 和NOS活性（1150±100）μkat L-1 也显著高于6h组（34±4）μmol L-1 ，（600±33）μkat L-1 ，且AVP干预组的NO含量和NOS活性均高于同时间点基础状态组（P&<0.05）.③CFs的NO含量和NOS活性随AVP浓度的增高而增加，其中10-6 mol L-1 AVP组（63±6）μmol L-1 ，（1100±50）μkat L-1 和10-7 mol L-1 AVP组（69±6）μmol L-1 ，（1200±50）μkat L-1 都显著高于对照组（29±5）μmol L-1 ，（450±83）μkat L-1 ，10-9 mol L-1 AVP组（32±2）μmol L-1 ，（500±133）μkat L-1 和10-8 mol L-1 AVP组（37±2）μmol L-1 ，（600±67）μkat L-1 （P&<0.05）.④不同浓度AVP干预下NO含量随NOS活性增强而增高，二者呈显著正相关（r=0.964，P&<0.01）. 结论 AVP能提高CFs的NOS-NO系统活性，而拮抗AVP的促MF作用.
　　
　　Keywords:cardiomyoplasty fibroblasts;nitric oxide syn-thase;nitric oxide;arginine vasopressin
　　
　　Abstract:AIM To investigate the changes of nitric oxide synthase-nitric oxide（NOS-NO）system activity in rat car-diac fibroblasts（CFs）with and without arginine vasopressin（AVP）treatment.METHODS CFs were isolated by trypsin digestion method.Nitric acid reductase method and spec-trophotometry were used to detect the NO contents and NOS activity in AVP group（with AVP treatment）and control group without AVP treatment respectively.RESULTS ①NO contents（42±5）μmol L-1 and NOS activity at36h（617±83）μkat L-1 were higher than those at6h（14±3）μmol L
-1 ，（167±67）μkat L-1 in control group.②NO contents（62±2）μmol L-1 and NOS activity at36h（1150±100）μkat L-1 were also higher than those at6h（34±4）μmol L-1 ，（600±33）μkat L-1 in AVP group.NO contents and NOS activity of AVP group were both higher than those of control group（P&<0.05）.③NO contents and NOS activi-ty increased in a dose-dependent manner in AVP group.NO contents and NOS activity under10-6 mol L-1 AVP treat-ment（63±6）μmol L-1 ，（1100±50）μkat L-1 and under10-7 mol L-1 AVP treatment（69±6）μmol L-1 ，（1200±50）μkat L-1 were both higher than those of control group（29±5）μmol L-1 ，（450±83）μkat L-1 ，those under10
-9 mol L-1 AVP treatment（32±2）μmol L-1 ，（500±133）μkat L-1 and those under10-8 AVP treatment（37±2）μmol L-1 ，（600±67）μkat L-1 （P&<0.05）.④NO contents increased with the enhancement of NOS activity with differ-ent concentrations of AVP，and there was significant positive correlation between them（r=0.964，P&<0.01）.CONCLUSION AVP increases NOS-NO system activity in neonatal rat CFs.The enhancement of NOS-NO system ac-tivity could inhibit myocardial fibrosis induced by AVP.
　　0 引言
　　
　　一氧化氮（NO）生成增多可舒张血管，降低血压，抑制高血压心肌纤维化（MF）的发生和发展.精氨酸升压素（AVP）收缩血管和抗利尿，并参与高血压的发生发展，促进MF［1］ .血浆AVP水平的慢性升高可提高肾髓质NOS蛋白的表达，使肾髓质NO浓度持续性升高，以维持心血管系统生理功能的平衡［2］ .但是，有关鼠心肌成纤维细胞（CFs）的一氧化氮合酶-一氧化氮（NOS-NO）系统活性的变化及其与AVP的关系还不清楚.我们以SD鼠CFs为研究对象，观察AVP干预下CFs的NOS-NO系统活性的变化，探讨MF的发生机制，对其防治提供新的思路.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 2～3d SD仔鼠（第四军医大学实验动物中心提供）.含酚红DMEM培养液由Gibco公司提供，无酚红DMEM培养基由Hyclone公司提供，胰蛋白酶由华美公司提供.小牛血清由杭州四季青公司提供.AVP由美国Peninsular Lab提供.NO含量和NOS活性测定试剂盒由南京建成生物技术研究所提供.
　　
　　1.2 方法 无菌条件下取SD仔鼠心室部分，无菌盐水漂洗后，剪至2～3mm2 小块，1.25g L-1 胰蛋白酶37℃消化20～40min，每5min收集1次细胞，将所得细胞置于含100mL L-1 小牛血清的DMEM培养液中，37℃，50mL L-1 CO2 孵箱中贴壁，差速贴壁法去除心肌细胞，细胞长至近融合状态时传代.对CFs进行SABC法免疫组织化学染色:纤维连接蛋白染色阳性，血管平滑肌肌动蛋白染色阴性，符合CFs染色特征.实验用2～3代细胞.将生长至融合状态的CFs消化成单个细胞悬液，以3000个/孔接种于96孔培养板，每孔200μL，培养至近融合状态时，无血清DMEM培养液驯化24h，分别加入培养液和不同浓度AVP，孵育预定时间.实验分为对照组、10-9 mol L-1 AVP组、10-8 mol L-1 AVP组、10-7 mol L-1 AVP组和10-6 mol L-1 AVP组.其中对照组和10-7 MAVP组分别测定6h和36h的NO含量和NOS活性.细胞取自同批培养的CFs.
　　
　　1.2.1 细胞培养液NO含量测定 用硝酸还原酶法，检测细胞培养液中的NO2- 含量，通过显色深浅读取吸光度，测定其浓度的高低.样品NO含量以公式（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×100μmol L-1 计算.
　　
　　1.2.2 细胞NOS活性测定 通过NOS催化产生的NO量推算NOS的活力.NO与亲核物质生成有 色化合物，测定其吸光度值可计算出NOS活力.NOS活性以每分钟生成的NO量表示，用公式（测定管吸光度-空白管吸光度）×2360μkat L-1 计算.统计学处理:数据以x ±s表示，应用SPSS统计软件进行t检验，单因素方差分析和直线相关分析.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 AVP干预下CFs的NOS活性和NO含量 在基础状态，CFs培养36h的NOS活性（617±83）μkat L-1 和NO含量（42±5）μmol L-1 显著高于6h（167±67）μkat L-1 ，（14±3）μmol L-1 （P&<0.05）.10-7 mol L-1 AVP干预下，CFs培养36h的NOS活性（1150±100）μkat L-1 和NO含量（62±1）μmol L-1 也显著高于6h（600±33）μkat L-1 ，（34±4）μmol L-1 （P&<0.05）.在相应时间点，10-7 mol L-1 AVP干预下CFs的NOS活性和NO含量都显著高于基础状态（P&<0.05）.不同浓度AVP干预CFs24h后，NO含量逐渐升高，呈剂量依赖性.其中10
-7 mol L-1 AVP组（69±6）μmol L-1 和10-6 mol L-1 AVP组的NO含量（63±6）μmol L-1 显著高于对照组（29±5）μmol L-1 ，10-9 mol L-1 AVP组（32±2）μmol L-1 和10-8 mol L-1 AVP组（37±2）μmol L-1 （P&<0.05）.10-6 mol L-1 AVP组的NO含量虽略低于10-7 mol L-1 AVP组，但无显著差异（P&>0.05，Fig1）.不同浓度AVP干预CFs24h后，NOS活性逐渐升高，呈剂量依赖性.其中10-7 mol L-1 AVP组（1200±50）μkat L-1 和10-6 mol L-1 AVP组的NOS活性（1100±50）μkat L-1 显著高于对照组（450±83）μkat L-1 ，10-9 mol L-1 AVP组（500±133）μkat L-1 和10-8 mol L-1 AVP组（600±67）μkat L-1 （P&<0.05）.10-6 mol L-1 AVP组的NOS活性虽略低于10-7 mol L-1 AVP组，但无显著差异（P&>0.05，Fig2）.
　　
　　2.2 NO含量与NOS活性的相关性 将不同浓度AVP干预24h的NO含量和NOS活性作相关分析显示:CFs的NO含量随NOS活性的增强而增高，NO含量与NOS活性呈显著正相关（r=0.964，P&<0.01，Fig3）.
　　
　　3 讨论
　　
　　MF是高血压左心室肥厚的重要病理学特征，是以心肌细胞和间质胶原网络数量、质量发生改变为特征的心脏重构，尤其是心肌间质纤维化使心肌硬度增加，顺应性下降，导致心脏舒张功能障碍，是心力衰竭、心律失常发生的重要环节.CFs是MF的主要效应细胞，CFs增殖、胶原合成分泌过多是MF的主要病理基础.我们以CFs为研究对象，探讨MF的促进因素AVP和MF的抑制因素NO二者之间的相互关系.AVP具有强烈的血管收缩作用，能促进血管平滑肌细胞增殖［3］ ，参与高血压的发生和发展，高血压病患者血浆中AVP水平增高，其增高程度与高血压病严重程度相关.AVP能够剂量依赖性地促进CFs增殖和胶原合成，促进MF.NO可抑制CFs增殖和胶原合成［4］ ，自发性高血压大鼠NOS活性明显不足［5］ ，给自发性高血压大鼠输注NO的前体物质L-精氨酸，可显著改善其MF的程度.在AVP作用下，体外培养的高血压病患者血管平滑肌细胞NOS mRNA表达量增高、NOS活性增强，NO含量增高［6］ .但是，AVP干预下CFs的NOS-NO系统活性的变化，目前尚不清楚. 　　图1 不同浓度AVP干预24h的NO含量变化　略
　　
　　图2 不同浓度AVP干预24h的NOS活性变化　略
　　　　
　　本研究表明，基础状态下体外培养的CFs具有NOS活性，能够产生一定量的NO，且培养时间延长，NOS活性增强，NO含量增加.基础状态下的 NO可拮抗循环和心肌组织局部AgII的致MF作用［7，8］ ，使正常心肌组织中的致MF因素和抗MF因素处于平衡状态.107 mol L-1 AVP干预后，不同时间点的NOS活性和NO含量都显著增加.这说明，AVP对CFs的NOS-NO系统的活性有促进作用.文献报道，当心脏压力负荷增加时，心肌组织自身可产生AVP［9］ .这表明，当内环境变化使致MF的损伤因素加强时，CFs能够自我保护性地上调抗MF因素，使致MF因素和抗MF因素仍然处于平衡状态.本结果还显示，CFs的NOS活性和NO含量随着AVP浓度的升高和作用时间的延长而显著增加，表明AVP对CFs的NOS-NO系统活性的促进作用具有剂量和时间依赖性.鉴于AVP和NO对MF具有相互拮抗的作用，可以认为，AVP诱导的CFs的NOS-NO系统活性增加可能属于生物体内的一种代偿性负反馈机制，以求最大限度地维持致MF因素和抗MF因素之间的平衡，保证心肌结构和功能的正常.但本研究也发现，当AVP浓度从10-7 mol L-1 再继续升高时，CFs的NO含量不再继续升高.这说明，CFs的代偿能力是有一定限度的.这时，如果致MF的损伤因素进一步加强，CFs产生的NO将不能产生完全的拮抗作用，心肌组织肯定会向着MF的方向发展.本研究还发现，在各种不同浓度AVP干预条件下CFs的NO含量随着NOS活性的增强而增加，二者呈显著正相关.由此可知，CFs的NO含量增加是由于NOS活性增强所致.NOS活性增强的原因可能是NOS基因表达增加或NOS蛋白合成增多，但其确切机制还有待于进一步探讨.
　　
　　图3 不同浓度AVP干预条件下CFs的NO含量和NOS活性的相关性　略　　
　　参考文献:
　　
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