关于Bax蛋白稳定高表达肝癌细胞的建立及其凋亡

论文代写网： 【关键词】 基因转染
　　关键词: bax基因;癌，肝细胞;基因转染;基因表达
　　摘 要:目的 建立稳定高表达Bax蛋白的肝癌细胞. 方法 用脂质体介导的基因转染法分别将含人bax cDNA的pBK-bax和pBK-CMV空载体质粒导入人肝癌细胞系HCC-9204细胞中.经G-418筛选获得细胞克隆.ABC法和图像定量分析检测Bax蛋白在细胞中的表达情况.HE染色观察细胞形态学变化.TUNEL法检测细胞凋亡发生情况. 结果 转染后用G-418筛选2wk，获得了细胞克隆.转染pBK-bax细胞的Bax蛋白表达强度明显强于转染pBK-CMV或未转染的HCC-9204细胞（P&<0.05），而转染pBK-CMV的细胞与未转染的HCC-9204细胞的Bax蛋白表达强度未见明显差异.pBK-bax转染的细胞有的可见细胞固缩、变圆、浓染和“出泡”等凋亡形态学变化，并且其TUNEL指数明显高于转染pBK-CMV或未转染的HCC-9204细胞（P&<0.05）. 结论 获得了稳定高表达Bax蛋白的肝癌细胞.bax基因转染的HCC-9204细胞凋亡率明显增高.
　　
　　Abstract:AIM To elucidate the adjusting function and op-erating mechanism of proapoptotic gene bax in the apoptotic process of hepatocellular carcinoma（HCC），and to establish the HCC cells which can express Bax protein stably and high┐ly.METHODS The plasmid of bacteriophague expression　vector pBK-bax，which contains human bax cDNA，was ex-tracted，and identified with agarose gel electrophoresis after cut by restricted endonuclease EcoRⅠ.The plasmids of pBK-bax and empty vector pBK-CMV were transduced into a HCC cell line HCC-9204cells，which express Bax protein at a lower level，with LipofectAMINE Lipid gene transfection method.The positive cell clones，which had been transduced with objective gene，were obtained with G-418screening.The expression of Bax protein in the HCC-9204cells prior to and after transfection with pBK-bax or pBK-CMV empty vec-tor，was detected with immunocytochemical ABC method and image-quantitative analysis.The morphological changes of the cells were observed after HE staining.The apoptotic situ-ation was detected with TUNEL method.RESULTS The agarose gel electrophoresis indicated that，there was bax cDNA fragment，which was about576bp after cut by re-stricted EcoRⅠ.The G-418-resistant cell clones，which had been transfected with pBK-bax or pBK-CMV empty vector，were obtained by screening with G-418for2wk continually after transfection.The image-quantitative analysis after im-munocytochemical staining indicated that，there was stronger expression of Bax protein in the cells which had been trans-fected with pBK-bax than those which had been transfected with pBK-CMV empty vector or untransfected HCC-9204cells.There wasn’t significant difference between pBK-bax or pBK-CMV transfected HCC-9204cells on the expression of Bax protein.There were morphological changes of apopto-sis，such as cell pyknosis，circled，densely stained and bub-bling，in some pBK-bax transfected cells，and its TUNEL in-dex was significantly higher than that of the cells transfected with pBK-CMV empty vector or untransfected.CONCLU┐SION Bax gene could be transfected into HCC-9204cells successfully，and the HCC cells that can express Bax protein stably and highly could be obtained.The apoptotic rate of bax gene transfected HCC-9204cells increases significantly.
　　
　　0 引言
　　
　　Bax是目前细胞凋亡研究中较为热门的促凋亡基因，属于细胞凋亡相关基因bcl-2家族.在多数情况下转染bax基因不仅能够使细胞生长受到抑制，而且能够促进多种因素诱导的多种细胞的凋亡［1-4］ .关于转染bax基因对原发性肝细胞癌（简称肝癌）细胞凋亡的影响及其作用机制尚未见报道.免疫细胞化学检测显示，HCC-9204是一株Bax蛋白表达相对较低的肝癌细胞系.我们用基因转染法把bax基因导入肝癌细胞系HCC-9204细胞中，建立稳定高表达Bax蛋白的肝癌细胞，并对其凋亡现象进行观察，为研究有关bax基因在肝癌细胞凋亡调控中的作用奠定基础.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 插有正向人bax cDNA（576bp）的pBK-bax噬菌粒表达载体菌种为本校免疫学教研室刘飞博士惠赠.pBK-CMV空载体质粒为上海第二医科大学司晓辉博士惠赠.人肝癌细胞系HCC-9204为本室建立，用含有150mL・L-1 新生牛血清的RPMI1640培养液在50mL・L-1 CO2 条件下培养.Wi-zard Plus质粒提取和纯化试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ购自美国Promega公司.脂质体介导的基因转染试剂盒LipofectAMINE和G-418为美国Gibco公司产品.鼠抗人Bax蛋白mAb为美国Oncogene公司产品.免疫组化ABC试剂盒为美国Vector公司产品.末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法凋亡检测试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品.
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 pBK-bax载体的鉴定 pBK-bax菌种经铺板活化后挑取单克隆菌株置于含卡那霉素的LB培养基中，37℃振摇12h.用Wizard Plus试剂盒提取并纯化pBK-bax质粒，经EcoRⅠ酶切后8g・L-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定.
　　
　　1.2.2 基因转染和细胞克隆筛选 参照Gibco公司的试剂盒说明书，用脂质体载体LipofectAMINE将pBK-bax质粒转染入HCC-9204细胞，同时设转染pBK-CMV空载体质粒和不转染的HCC-9204细胞对照.3d后换用含有500mg・L-1 G-418的新鲜培养液继续培养，2～3wk后当未转染的HCC-9204细胞对照全部死亡、并且转染的细胞大多数死亡时，收集G-418抗性的细胞克隆，扩大培养.
　　
　　1.2.3 免疫细胞化学染色和图像定量分析 ①染色方法:在盖玻片上生长至对数期的细胞用950mL・L-1 乙醇固定15min.分别经3mL・L-1 h3 O2 和3mL・L-1 Triton X-100处理后，加正常羊血清，37℃，30min.加鼠抗人Bax mAb，37℃，1h.加生物素化的羊抗鼠IgG mAb，37℃，30min.加ABC复合 物，37℃，30min.除加正常羊血清一步外，上述各步之间均用PBS洗.用新鲜配制的DAB显色10min.脱水，透明，封片;②图像分析:采用HPIAS-1000彩色病理图文分析系统中的免疫组化定量分析窗口.每张切片在显示器上随机选取40×视野（向同一方向移动切片，不重复，不重叠），计数约500个细胞.由计算机给出所测单个细胞的吸光度（A）值.计算各例细胞的A值x ±s.数据经两组均数的t检验.
　　1.2.4 细胞凋亡检测 HE染色按常规方法进行.TUNEL法检测:①细胞爬片晾干并经40g・L-1 多聚甲醛固定30min;②置4℃穿透液（含1g・L-1 Triton X-100的1g・L-1 枸橼酸钠）中2min;③焦碳酸二乙酯（DEPC）水洗，静置30min;④用FITC标记的核苷酸和脱氧核苷酸末端转移酶组成的TUNEL反应液37℃染色60min，以PBS代替TUNEL反应液作为阴性对照，荧光显微镜观察.计算TUNEL指数（阳性细胞数除以总细胞数）.数据经χ2 检验.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 pBK┐bax载体的鉴定 琼脂糖凝胶电泳显示，pBK-bax质粒约为5.1×103 bp，经EcoRⅠ酶切后约为4.5×103 bp（切开的pBK-CMV载体）和576bp（切开的bax cDNA）的两条基因片段（Fig1）.
　　
　　图1 8g・L-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定pBK-bax质粒　略
　　
　　2.2 细胞克隆筛选 在含有G-418的培养液中，未转染的HCC-9204细胞对照在转染后1wk内全部死亡，2wk时转染细胞组的大部分细胞死亡，并可见散在生长的G-418抗性细胞克隆（Fig2）.
　　
　　2.3 免疫细胞化学染色图像定量分析 Bax染色阳性信号为棕黄色，位于HCC-9204细胞的细胞质.转染pBK-bax，转染pBK-CMV空载体和未转染的HCC-9204细胞的A值分别为0.28±0.11，0.18±0.07和0.17±0.05.转染pBK-bax与转染pBK-CMV空载体或未转染组之间均具有显著性差异（P&<0.05，Fig3）.转染pBK-CMV空载体与未转染组之间未见明显差异（P&>0.05）.
　　
　　图2 － 图4 略
　　
　　2.4 细胞凋亡检测
　　
　　2.4.1 HE染色 pBK-bax转染的细胞多数未见明显的形态学变化，可见有的细胞出现固缩、变圆、浓染和“出泡”等凋亡形态学变化（Fig4）. 　　2.4.2 TUNEL法检测 转染pBK-bax，转染pBK-CMV空载体和未转染的HCC-9204细胞的TUNEL指数分别为0.23±0.08，0.12±0.05和0.09±0.03.转染pBK-bax与转染pBK-CMV空载体或未转染组之间均具有显著性差异（P&<0.05）.转染pBK-CMV空载体与未转染组之间未见明显差异（P&>0.05）.
　　
　　3 讨论
　　
　　Bax是1993年首先在人和小鼠的B淋巴细胞中发现的一种Mr 21×103 的蛋白质.Bax与Bcl-2的作用相反，能够促进细胞凋亡.Bax蛋白能够通过bcl-2家族成员共有的BH1，Bh3或BH3区域与另一个Bax分子形成同源二聚体，或与Bcl-2，Bcl-xL，Mcl-1，A1等分子形成异源二聚体.当Bax主要以同源二聚体的形式存在时，细胞容易自发凋亡或在外界因素诱导下发生凋亡［5］ .Bax蛋白在多数肿瘤组织和细胞中具有较高程度的表达［6，7］ .关于Bax蛋白在肝癌中的表达情况尚有争议.有报道认为肝癌组织的Bax蛋白表达水平明显低于肝硬化组织和癌旁肝组织，也有的作者认为肝癌组织的Bax蛋白表达程度明显高于癌旁肝组织和正常肝组织，目前获得共识的是肝癌中一般均有一定程度的Bax蛋白表达［8-10］ ，说明bax基因在肝癌细胞凋亡中可能具有一定的调节作用.虽然多数报道认为，向细胞内转入bax基因可诱发许多细胞的自发凋亡，并且能够促进放射线或化疗药物等多种因素诱导的多种细胞的凋亡［1-4］ .但是也有学者认为，有的情况下bax不但不能促进细胞凋亡，反而抑制某些细胞的凋亡［11］ .说明bax在不同细胞的凋亡调控中的作用有所差异，还有其他因素参与bax对细胞凋亡的调节过程，其发生机制还不清楚.我们采用的pBK-bax表达载体是通过把bax cDNA片段克隆在pBK-CMV噬菌粒表达载体的EcoRⅠ酶切位点上构建而成［5］ .pBK-CMV具有分别用于真核和原核表达的两种启动子，能够使其携带的外源基因在真核细胞和原核细胞中均可表达.pBK-CMV载体还含有可表达抗氨基甙类抗生素（Geneticin或G-418）蛋白的neo基因.将含有目的基因的pBK-CMV质粒转染入细胞后用G-418持续筛选，未转入目的基因的细胞被杀死，转入了目的基因并稳定表达目的蛋白的细胞因具有G-418抗性而呈克隆状生长，可获得成功地转染了目的基因的细胞克隆.脂质体是内脂质双分子层组成的环状封闭囊泡，它可以和DNA形成脂类-DNA复合物，该复合物能够以内吞的方式进入细胞，从而使目的基因转入细胞.以LipofectAMINE为代表的脂质体介导的基因转染产品，是目前常用的高效率基因转移方法［12］ .本实验中，用G-418（500mg・L-1 ）连续筛选2wk后获得了转入bax基因的细胞克隆.免疫细胞化学染色图像定量分析结果显示，转入bax基因的细胞对Bax蛋白的表达明显强于转染pBK-CMV空载体或未转染的HCC-9204细胞，而转染pBK-CMV空载体的细胞与未转染的HCC-9204细胞的Bax蛋白表达强度未见明显差异.说明成功地把bax基因转染到Bax蛋白表达水平相对较低的HCC-9204肝癌细胞中，建立了稳定高表达Bax蛋白的肝癌细胞模型.转染bax基因后细胞的TUNEL指数明显增高，虽然转染bax基因后只有少数HCC-9204细胞出现了固缩、浓染和“出泡”等凋亡形态学变化，总的说来细胞形态学变化不很明显，仍可说明bax基因转染能够使HCC-9204细胞凋亡趋势增强.本实验为进一步应用此高表达Bax蛋白的肝癌细胞进行bax基因在肝癌细胞凋亡调控中的作用及其机制的研究，以及探讨bax基因在肝癌基因治疗中的意义奠定了实验基础.
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