关键词: 关节/细胞学软骨细胞;细胞培养;胰岛素样生长因子-1;细胞周期
摘 要:目的 了解胰岛素样生长因子-1（IGF1 ）对体外生长的兔关节软骨细胞的生物学效应，为组织工程构件软骨提供理论基础. 方法 取第3代兔关节软骨细胞体外单层培养，培养液DMEM中以终浓度分别为1，10，100μg L-1 的IGF1 各作用细胞2，4及6d，以MTT法检测细胞的增殖情况，并在100μg L-1 IGF1 作用下，采用流式细胞技术进行细胞周期亚时相分析.同时，检测基质中糖醛酸的变化反映蛋白多糖含量的变化. 结果 结果显示在1～100μg L-1 浓度下IGF1 能明显促进培养软骨细胞的增殖，且以100μg L-1 作用4d刺激效果最明显;并能显著影响细胞外基质中糖醛酸的含量. 结论 IGF1 对培养软骨细胞以剂量时间依赖性方式刺激其增殖及功能代谢.
Keywords:joints/cytology chondrocytes;cell culture;in-sulin-like growth factorⅠ;cell cycle
Abstract:AIM To explore the effects of insulin-like growth factor-1（IGF1）on the metabolism of articular chondrocytes and their matrix.METHODS Monolayer cells of3-genera-tion obtained from4-week rabbit were cultured in DMEM containing10%fetal calf serum and were treated with IGF1 with doses ranging from1to100μg L-1 over2d，4d and6d periods.Effect of IGF1 was assessed on the proliferation of chondrocytes was measured by MTT method and the glucuronic acid content，which reflected the functions of chondrocytes，and on the cyclic change of the cells.RE┐SULTS IGF was found to stimulate cell proliferation and matrix metabolism in a dose-and time-dependent manner.The maximal effect of stimilation occurred at100μg L-1 within4d after treatment.CONCLUSION Cell prolifera-tion and matrix metabolism in the cultured articular chondro-cytes can be stimulated by IGF1.
0 引言
胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth fac-tor-1IGF-1 ）是体内重要的细胞因子之一.20世纪80年代曾有过大量研究［1，2］ .近年来，随组织工程学的发展，利用细胞、载体及生长因子联合修复关节软骨缺损成为极具前景的研究课题.我们旨在研究在体外状态下，IGF1 对软骨细胞的作用及其最佳量效关系，为关节软骨的修复及治疗提供相关依据.
1 材料和方法
1.1 软骨细胞的培养 用胶原酶消化法［3］ 分离软骨细胞.取4wk龄新西兰白兔，处死，无菌片状切取肱骨近端，股骨近、远端及胫骨近端关节面软骨，Hanks液冲洗3次.用5g L-1 的透明质酸酶（上海浦东生化试剂厂）室温消化3min，Hanks液冲洗.再将软骨片切成0.1cm×0.5cm×0.5cm的小粒，分别经2.5g L-1 胰蛋白酶、2g L-1 胶原酶（上海浦东生化试剂厂），于37℃消化30及60min，用含100mL L-1 小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）的DMEM（USA Gibco公司）终止消化后，过滤除碎块，滤液经1500r min-1 离心3min收集细胞.用培养液洗1次，再用培养液悬浮细胞，将细胞密度调至3×105 个 mL-1 ，接种于培养瓶中于37℃恒温，50mL L-1 CO2 浓度，饱和湿度中培养箱（USA Nuair公司）培养.培养液由DMEM培养基加100mL L-1 小牛血清、青链霉素各100u mL-1 组成.原代细胞贴壁并融合成单层细胞后，传代培养.
1.2 IGF1 对兔关节软骨细胞增殖的影响
1.2.1 四唑盐法检测IGF1 对细胞增殖的影响 取生长良好的第3代软骨细胞，按每孔2×103 个细胞100μL分别接种6块96孔培养板（USA Filcon公司），置于培养箱.培养24h，每块培养板按10孔为一个浓度组，分别换入含生长因子的DMEM培养基，使IGF1 （华美生物工程公司）的最终浓度分别为1，10，100μg L-1 ，另10孔仍换原培养液.再培养2，4，6d后，以四唑盐（MTT）（USASigma公司）比色法测细胞相对数（A值），计算每种因子浓度组光吸收值的平均值，行统计学处理.
1.2.2 应用流式细胞仪对IGF1 作用于软骨细胞的周期进行分析 取4代生长状态良好的软骨细胞6瓶，用2.5g L-1 胰蛋白酶消化制成5×105 mL-1 的细胞悬液，传至200mL大培养瓶共10瓶，每瓶加4mL.培养24h后，向培养瓶内加入IGF1 使最终浓度分别为100μg L-1 ，再继续培养48h.收集细胞，常规样本制备，行流式细胞仪细胞DNA周期测定.
1.3 IGF1 对软骨细胞基质中葡萄糖酸含量的影响 第3代软骨细胞按3×105 /瓶接种到25cm2 方形培养瓶中，各瓶细胞随机分为13组，每组4瓶，除对照组及加因子前外对照组不加因子外，其它组于24h后换入不同浓度IGF1 ，分别作用2，4，6d，每2d换培养液1次，并相应添加因子.终止培养时收获细胞，收集细胞周围基质，用咔唑硫酸法［3］ 测基质中糖醛酸含量.
统计学处理:检测数据用F检验及t检验.
2 结果
2.1 细胞形态的观察 整个实验过程中严密观察细胞形态，倒置显微镜下（日本Olympus公司），细胞形态始终为多角形或星形，未发现异常形态细胞.
2.2 IGF1 对兔关节软骨细胞增殖的影响
2.2.1 四唑盐法检测IGF1 对细胞增殖的影响 如Tab1所示，IGF1 有促细胞增殖作用.作用后的细胞相对数分别为对照组的2.1倍，最大刺激浓度为100μg L-1 .最大刺激效应发生在第4d. 2.2.2 应用流式细胞仪对IGF1 作用于软骨细胞的周期进行分析 根据流式细胞仪检测细胞周期各阶段百分比的结果，进一步分析了细胞增殖达高峰细胞周期各阶段细胞数的百分比，结果与对照组比较，G1 期细胞数明显增加（P&<0.05，Tab2）.说明在IGF1 作用下，大部分细胞进入G1 期，细胞增殖活跃.
2.3 IGF1 对兔关节软骨细胞基质中糖醛酸含量的影响 细胞培养24h，每瓶细胞基质中糖醛酸含量平均为（39.4±1.9）μg，其余时间各组测定见Tab3.
表1 IGF1 对软骨细胞增殖的影响 略
表2 IGF1 对细胞周期各阶段细胞数的百分比的影响 略
表3 IGF1 对细胞基质中糖醛酸含量的影响 略
3 讨论
如何获取表型稳定、增殖旺盛的种子细胞是软骨组织工程需解决的重要课题之一.软骨细胞体外培养时往往容易产生去分化、表型不够稳定，常需要添加一定的生长因子.
IGF1 是一种既有促进细胞增殖活性，又具有胰岛素样作用的多肽，其作用广泛［3，4］ .就对软骨细胞而言，IGF1 不仅能刺激细胞分裂增殖，而且增强细胞功能，促进蛋白多糖（PG）及Ⅱ型胶原的合成［5，6］ .尤其对IL-1等造成的蛋白多糖减少，IGF1 能明显地加速PG合成，降低PG分解［7］ ，从而提高蛋白多糖量，利于软骨修复.
本实验以IGF1 在DMEM为培养基条件下，作用于4wk龄新西兰白兔的四肢关节正常软骨细胞，整个实验过程中，细胞表型稳定，无异型细胞出现，对细胞功能的维持有重要意义.且在1～100μg L-1 浓度范围内，IGF1 能显著促进细胞增殖，表现为剂量-时间依赖效应.可以满足种子细胞大量增殖的需要.
为试图说明对软骨细胞增殖作用的可能机制，选用对软骨细胞作用的最佳IGF1 浓度，通过对作用后细胞周期细胞数百分比改变的分析，我们发现实验组较对照组软骨细胞G1 期与对照组有显著差异，说明在IGF1 作用下，大部分细胞进入G1 期，推测细胞在因子作用下可能加快了mRNA的转录和各种蛋白质的翻译合成以及各种细胞器的组装［8］ .以此促进细胞增殖.
关节软骨功能的维持几乎完全依赖于软骨基质的结构完整及胶原纤维（Ⅱ型胶原）和蛋白多糖（核心蛋白为aggrecan）间的有机结合.软骨组织中胶原的代谢速度缓慢，维持相对恒定，而PG的代谢速度则较快.老年软骨和受到严重损伤的软骨中，软骨细胞不能有效地合成PG，严重影响了软骨的力学性能［9］ .因此，含量对工程化软骨至关重要.我们进一步证实IGF1 对细胞外基质中糖醛酸的促进作用.糖醛酸是蛋白多糖（PG）代谢中间产物，能间接反映基质中PG的含量.
参考文献
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