关于双光气致急性损伤对兔肺泡Ⅱ型细胞形态学的影响

【关键词】 肺泡/细胞学
　　【Abstract】AIM：To study the changes of pulmonary alveolar type Ⅱ epithelial cells in rabbit lung injured by diphosgene acutely and to find out the mechanism of the lung injury by diphosgene. METHODS： Japanese rabbits were chosen as the experimental animals and were randomly pided into six groups: Negative control group (n=10) and 0， 2， 4， 8 and 12 h groups after diphosgene exposure (n=5 in each group). Following exposure to diphosgene， rabbits were killed， lungs were taken out and lavaged and the content of phospholipid in pulmonary alveolar type Ⅱ epithelial (PATE) cells was detected. The changes of pulmonary alveolar type Ⅱ epithelial cells were also observed under electron microscope. RESULTS： The PATE cells changed morphologically in groups exposed to diphosgene. After exposure to diphosgene， the content of phospholipid in PATE cells in the exposed groups was remarkably lowered than that in normal control group (P&<001). Compared with that of the control group， the content of phospholipid in PATE cells in the exposed groups decreased greatly 2 hours after the exposure and increased 4 hours after the exposure (P&<005). 8 hours after the exposure， it gradually descended again. CONCLUSION： Our results indicate that diphosgene can indirectly injure the pulmonary alveolar type Ⅱ epithelial cells by injuring PATE cell surfactant and cell shapes. The injury process can be pided into four phases: nonlethal phase， compensatory phase， decompensatory phase and lethal phase.
　　【Keywords】 diphosgene; lung linjuries; pulmonary alveoli/cytology
　　【摘　　 要】目的： 通过对日本大耳兔双光气肺损伤后肺泡Ⅱ型细胞内磷脂和形态学变化的观察，探讨双光气对肺Ⅱ型细胞的损伤及其机制.方法： 将纯种日本大耳白兔35只随机分为对照组（n=10）、染毒即刻组（n=5）、染毒2 h组（n=5）染毒4 h组（n=5）、染毒8 h组（n=5）、染毒12 h组（n=5）；采用浓度―时间法动态式染毒，染毒后按不同时间点对实验动物进行颈总动脉插管放血处死，取肺并用肺灌洗液对支气管肺泡进行灌洗，然后取肺组织作冰冻切片，进行电镜观察，并测定细胞内磷脂含量.结果： 肺Ⅱ型细胞内磷脂含量在染毒即刻开始时较正常组含量下降（P&<001）；在染毒2 h时降到最低，之后上升（P&<005），而在4 h后又下降（P&<005）.染毒终止后，损伤逐渐加重，染毒后2 h磷脂因消耗而降低.染毒后4 h，由于代偿功能启动，磷脂短暂升高，出现致伤性代偿期.从染毒2 h后开始，细胞损伤加重，磷脂合成进入失代偿期，合成逐渐减少.到染毒后8 h，肺泡Ⅱ型细胞内细胞处于致伤性和致死性细胞改变的临界点，细胞出现致死性改变，磷脂合成、分泌停止，细胞出现死亡.结论： 兔在双光气染毒12 h内，肺泡表面活性物质磷脂的改变有差异，随细胞损伤程度发生改变，出现明显中毒分期：即致伤性改变期、致伤性代偿期、致伤性失代偿期、致死性改变期.
　　【关键词】 双光气；肺/损伤；肺泡/细胞学
　　0　　 引言
　　双光气具有酰氯结构，化学性质活泼，可与磷脂分子中的磷脂胆碱相互作用［1］，发生氨解作用，改变磷脂胆碱的结构和功能.据文献报道，双光气染毒可破坏肺泡表面活性物质，因而也会影响磷脂蛋白复合物的代谢［2］.但是，关于双光气染毒后肺 Ⅱ 型细胞随染毒时间发生的形态学变化所见报道不多.我们通过动态恒流染毒，观察双光气染毒后不同时间肺 Ⅱ 型细胞的形态学变化，探讨表面活性物质损伤的原因和机制.
　　1　　 材料和方法
　　1. 1　　 材料　　 纯种日本大耳白兔35只（第四军医大学实验动物中心提供），雌雄不拘， 体质量（30±08） kg，随机分为对照组（n=10）、即刻组（n=5）、2 h组（n=5）、4 h组（n=5）、8 h组（n=5）、12 h组（n=5）；雌雄分开喂养，自由摄食、饮水，处理前12 h停喂饲料和水.MPV3型显微分光光度计（西德Leitz公司），1720型冰冻切片机（西德Leitz公司）.试剂：消化液（将280 mL与700 mL・L-1过氯酸(AR)65 mL用蒸馏水配成1000 mL溶液），显色剂（钼酸铵(AR)25 g和无水醋酸钠(AR)82 g溶于蒸馏水中并稀释至100 mL，并与100 mL・L-1的抗坏血酸按91混合），储备液（将04393 g磷酸二氢钾配成100 mL溶液之后加入1 mL氯仿(AR)作为储存液保存），磷应用液（将储备液2 mL稀释至50 mL备用），固定液（取甲醛（AR 400 g・L-1）20 mL与100 g・L-1氯化钙10 mL溶于80 mL蒸馏水中），媒染剂（重铬酸钾(AR) 5 g加氯化钙1 g溶于100 mL水中）染色液（酸性苏木精溶液由50 mg苏木精(AR)溶于48 mL蒸馏水中，再加入10 g・L-1的高碘酸钠(AR)溶液1 mL煮沸后加入冰醋酸1 mL即可）灌洗液（4℃生理盐水）.
　　1.2　　 方法　　 将动物置于染毒柜中，温度为30℃，采用浓度时间法动态式染毒，毒剂浓度为（300±20）μg・L-1，染毒时间为20 min.染毒后，各实验组动物分别于0，2，4，8和12 h行颈总动脉插管放血处死.处死后立即剖开胸腔，取出肺脏，用肺灌洗液按30 mL・kg-1的剂量，对支气管肺泡分3次充分灌洗.所得的灌洗液混匀后离心，800 r・min-1 ， 10 min，取上清备用；肺组织用甲醛-钙溶液固定，作冰冻切片备用.
　　1.2.1　　 肺灌洗液中磷脂总量的测定　　 取肺灌洗上清液3 mL，加2倍体积的氯仿甲醇（21）混合液，充分混旋，静置12 h后离心（100 r・min-1 ，10 min）分相，吸取下相液1 mL，放入试管中，沸水浴至溶剂挥发干，加入消化液02 mL，另取2个试管作为标准管及空白管，分别加入消化液02 mL，在标准管中再加入磷应用液01 mL.将测定管、标准管及空白管都置于电炉上消化（1000 W加热5~8 min），测定管内先变成棕黑色，迅速变清后取下，待冷却后各管分别加入显色剂2 mL，并60~70℃水浴10 min，冷却后用700nm波长进行比色测定，计算含量.
　　1.2.2　　 肺泡Ⅱ型细胞内磷脂含量的测定　　 新鲜肺组织在4℃的100 g・L-1甲醛钙液中固定1 h后，作6~10 μL的冰冻切片；放入媒染剂中，室温18 h；蒸馏水充分浸洗后，放入37℃染色液中5 h；蒸馏水洗尽，入硼砂铁氰化钾液（37℃，18 h）；蒸馏水洗尽，甘油明胶封片；显微分光光度计吸收光谱法进行磷脂定量分析（λ为610 nm，放大倍数10×40），并观察细胞形态改变.
　　统计学处理：数据均用x ±s表示，采用完全随机的方差分析，结果由统计软件SPSS（windows 10.0版）oneway ANOVA中的LSD统计整理.
　　2　　 结果
　　2. 1　　 双光气染毒肺Ⅱ型细胞的变化　　 光镜下可见对照组肺Ⅱ型细胞的核蛋白、卵磷脂和神经磷脂呈蓝黑色，粘液物质呈深蓝色，纤维蛋白呈淡蓝色，而细胞质无色或稍显黄色，细胞轮廓清晰，染色适中（Fig 1）；在染毒即刻组中可见阳性着色减轻（Fig 2），在染毒2 h组阳性着色更浅，但轮廓尚清晰（Fig 3），染毒后4 h后着色逐渐加深，轮廓逐渐模糊（Fig 4），而在8 h后，染色更浅，轮廓完全模糊不清（Fig 5），并有巨噬细胞侵润.
　　2.2　　 肺泡Ⅱ型细胞内磷脂含量的变化　　 染毒即刻开始肺Ⅱ型细胞内磷脂较正常组含量下降［（24±2） vs（21±10），P&<001］，染毒后2 h下降至最低值（18±12），之后到染毒后4 h内，磷脂合成又升高，8 h下降至与染毒前相当的水平（24±6）. 　　3　　 讨论
　　本实验中，我们选择了浓度为（300+20）μg・L-1的染毒剂量以及20 min的染毒时间，以制作双光气肺损伤模型.从实验结果看，染毒的剂量和时间选择都是合适的.双光气染毒使实验动物肺泡Ⅱ型细胞出现损伤，Ⅱ型细胞内的磷脂含量降低，并呈现规律性变化.对于光气和双光气的损伤机制，目前尚无一致的认识.有报道表明，双光气对肺的损伤主要表现为ARDS［3］，而肺表面活性物质在ARDS中发挥着重要作用.从理论上讲，肺表面活性物质作为维持肺泡正常功能的重要物质［4］，外界各种因素会首当其冲地与其发生作用［5］.肺泡上皮Ⅱ型细胞作为磷脂合成场所，双光气中毒时必然受到累及［6］.双光气染毒后，光镜下可见在染毒即刻组中磷脂含量减少，染毒2 h磷脂含量最低，但细胞轮廓尚清晰，表明双光气中毒可造成细胞非致死性损伤；但染毒后4 h后着色逐渐加深，说明Ⅱ型细胞内磷脂含量出现反应性代偿性合成增加，细胞轮廓逐渐模糊，损伤逐渐加重，而在8 h后，中毒损伤加重，细胞出现致死性改变，磷脂合成处于失代偿状态，细胞结构出现分解，并有巨噬细胞侵润.双光气染毒早期细胞内的磷脂含量下降，说明双光气染毒对细胞及其膜通道的损伤较小，其分泌功能未受影响.2 h之后，磷脂含量回升，此时，由于肺泡水肿，引发过度通气，从而反应性地使未受损的Ⅱ型细胞大量合成和分泌磷脂，出现细胞内的磷脂含量的一过性增多，因此，Ⅱ型细胞内磷脂含量也有所增加.此后，细胞内含量下降，这可能是因为双光气造成细胞的缺氧以及炎性白细胞释放的炎性介质自由基进一步损伤其合成和分泌功能，Ⅱ型细胞不能回收肺泡内的磷脂，从坏死的细胞内或肺泡表面脱落少量磷脂并在肺泡内聚集，因此，细胞的形态学变化则很准确地反映了染毒时间内的磷脂含量的变化.
　　因此，肺泡表面活性物质磷脂的改变，随细胞损伤程度发生改变，包括致伤性改变期、致伤性代偿期、致伤性失代偿期、致死性改变期.在双光气致肺损伤的早期就有异常变化，但属于致伤性改变期.尽管已经终止染毒，但损伤逐渐加重，染毒后2 h磷脂因消耗而降低.因此，代偿功能启动，因而会有磷脂的短暂升高，出现致伤性代偿期.从染毒2 h后开始，细胞损伤加重，磷脂合成进入失代偿期，逐渐合成减少.到染毒后8 h，肺泡Ⅱ型细胞内细胞处于至伤性和致死性细胞改变的临界点，细胞出现致死性改变，磷脂合成、分泌停止，细胞出现死亡.这些异常变化是双光气中毒后，细胞损伤，形成肺水肿形态学基础，因此其变化在肺损伤机制中有重要意义.
　　图1　　 正常组兔的肺泡组织冰冻切片（略）
　　Fig 1　　 Freeze slice of pulmonary alveolar in normal rabbits　　 10×40（略）
　　图2　　 双光气急性染毒后即刻肺泡组织变化的冰冻切片（略）
　　Fig 2　　 Changes of pulmonary alveolar in rabbits after an acute injuried immediately by diphosgene　　 freeze slice　　 ×400（略）
　　图3　　 双光气急性染毒后2 h时肺泡组织变化的冰冻切片）（略）
　　Fig 3　　 Changes at the second hour of pulmonary alveolar in rabbit after an acute injuried by diphosgene　　 freeze slice　　 ×400（略）
　　图4　　 急性双光气染毒后4 h时肺泡组织变化的冰冻切片（略）
　　Fig 4　　 Changes at the fourth hour of pulmonary alveolar in rabbit after an acute injuried by diphosgene　　 freeze slice　　 ×400（略）
　　图5　　 急性双光气染毒后8 h时肺泡组织变化的冰冻切片（略）
　　Fig 5　　 Changes at the eighth hour of pulmonary alveolar in rabbit after an acute injuried by diphosgene　　 freeze slice　　 ×400（略）
　　【参考文献】
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