作者：严泉剑 李六金 张宇梅 杨贵忠 刘海军 郭金龙 王禾 邵国兴
【关键词】 ，骨髓基质细胞
【Abstract】 AIM: To investigate the function parameters of tissue engineered bladders with marrow stromal cells（MSCs）. METHODS： The MSCs and the bladder-shaped accellular organ specific matrix (BAMG) were obtained from the New Zealand White rabbits. The exterior surface of BAMG was seeded with the resuspended MSCs. A total of 20 rabbits underwent a trigone-sparing cystectomy. The animals were randomly assigned to three groups. Group A (n=6) underwent a closure of the trigone without a reconstructive procedure. Group B (n=7) underwent a reconstruction using a BAMG only and Group C (n=7) underwent a reconstruction using a BAMG plus autologous MSCs. Preoperative and postoperative cystometry and radiography studies were performed serially. Animals were euthanized at 12 weeks. Gross and histological analyses were also performed. RESULTS： The average time elapsed between the initial marrow biopsy and the final implantation of the tissue-engineeredneobladders was （21±3） days (x±s). Post operation， the average capacities in Group A， B and C were 22%， 85% and 95%， respectively and showed a marked difference in bladder compliance (11%， 104%， and 107% respectively). Histologically， group C showed a normal cellular organization consisting of a trilayer of urothelium， submucosa and muscle. The Group A， B presented a pattern of normal urothelial cells with a thickened fiberotic submucosa and a thin layer of muscle fibers. CONCLUSION： Our study demonstrates that the MSCs can be successfully used in rabbits bladder augmentations and replacement by tissue engineering techniques.
【Keywords】marrow stromal cells; bladder; transplatation; tissue engineerig
【摘 要】目的: 研究骨髓基质细胞（MSCs）在兔组织工程膀胱中的应用.方法:按文献改进方法制作膀胱无细胞基质(BAMG)，从兔胫骨中分离出MSCs，体外扩增后接种于BAMG外表面，在低糖DMEM（LGDMEM）培养12 h，与BAMG复合成组织工程膀胱，对同一兔实施膀胱次全切术，用组织工程膀胱替代.20只兔实施了保留三角区的膀胱次全切术.实验随机分为3组.A组6只直接缝闭三角区；B组7只用膀胱形状的BAMG进行重建；C组7只用复合自体MSCs的组织工程膀胱进行替代手术.术前术后分别记录膀胱测压和放射线造影资料.12 wk时无痛处死动物，进行大体解剖和组织染色分析.结果: 体外扩增时间平均为21 d.A，B和C组膀胱容积分别为术前的22%， 85%和95%，顺应性分别为术前的11%， 104%和107%.大体解剖显示A组仅有很小的储水能力，而B，C组具有正常膀胱形态，组织染色分析A，B组显示上皮层正常，粘膜下纤维组织增生而肌层较薄；C组则显示了与自体膀胱相似的正常的3层组织结构.结论: 膀胱次全切除后原位缝合膀胱容积和顺应性均不能恢复，单纯应用BAMG膀胱容积和顺应性能够恢复正常，但逼尿肌层较薄，应用BAMG复合自体ASCs或MSCs的组织工程膀胱替代，术后12 wk膀胱容积和顺应性能够恢复正常，膀胱壁组织结构与正常膀胱相似.提示膀胱次全切除后应用BAMG复合自体MSCs的组织工程膀胱替代可以获得良好功能和组织结构.
【关键词】 骨髓基质细胞；膀胱； 移植； 组织工程
0 引言
目前用于构建组织工程膀胱的细胞多为自体上皮细胞和平滑肌细胞，体外培养周期约为4 wk［1］，而我们用MSCs与无细胞基质材料复合成组织工程膀胱，构建周期为3 wk.本实验评估其在新西兰兔膀胱次全切替代手术中的应用价值.
1 材料和方法
1.1 BAMG材料制备 膀胱无细胞基质生物材料按本试验室改进方法准备［2］.膀胱取自6月龄新西兰兔.组织（没有刮除上皮细胞）置入50 mL 10 mmol・L-1 PBS (pH 70)和1 g・L-1的叠氮钠搅拌6 h使部分细胞溶解.在50 mL含2000 Kunitz单位DNA酶（Sigma）的1 mol・L-1 NaCl 溶液中振摇14 h， 重复3次.然后在50 mL 40 g・L-1去氧胆酸钠盐（含1 g・L1叠氮钠）中振摇6 h.获取的BAMG在PBS中洗3遍.4℃置于1 g・L-1叠氮钠和100 g・L-1硫酸新霉素中储存.
1.2 MSCs分离培养 全骨髓细胞获取（whole marrow cells， WMCs）：用骨穿针在6 mo龄实验用新西兰兔的胫骨穿刺点，即关节腔下10～25 cm 胫骨前缘处穿刺抽取骨髓［３］，注射器吹散，所获有核细胞计数.以(01~20) × 107・mL-1 细胞溶于含100 mL・L-1胎牛血清（FBS）的 低糖DMEM（LGDMEM）培养液 (GIBCO/BRL) 备用.内毒素水平低的FBS批次选择：置 55℃灭活1 h ，用于在琼脂糖凝胶上全骨髓细胞培养，1 wk内获得最大的克隆形成单位的同一批次血清用于实验［４］.
MSCs获取：(1~5) × 107 有核骨髓细胞，用25 mL含100 mL・L-1 FBS的 LGDMEM稀释后，置于 75 cm2 培养瓶(Falcon)，3 d后，移去一半培养液及未贴壁细胞，加入等量新鲜培养液，以后换液间隔为3~4 d， 细胞融合时收获细胞.收获细胞前移去培养基，用PBS洗两遍.然后用4 mL的25 g・L-1 胰酶和05 mmol・L-1 EDTA (GIBCO/BRL) 在 37℃孵育20 min. 用 8 mL 完全培养基终止消化.弃去仍贴壁细胞，消化所获细胞（大部分来自克隆集落中心周围细胞）即为MSCs.500 g 离心15 min收集的MSCs 以(01～20)× 107・mL-1细胞浓度重悬于含100 mL・L-1 FBS的LGDMEM培养基.
1.3 组织工程膀胱构建 将收集的MSCs最终以106・cm-2密度在BAMG的外表面上接种.12 h后用于膀胱替代手术.
1.4 膀胱切除与重建 新西兰兔手术麻醉为静脉给予苯巴比妥(30 mg・kg-1).
腹部正中切口暴露膀胱，分离两侧输尿管.切开膀胱壁，暴露输尿管连接处，插入4F导管.实施膀胱次全切术，保留三角区，尿道内口，输尿管连接部，注意不要损伤输尿管.6只动物三角区缝闭后不做任何处理（n=6，第1组，A）；7只单用BAMG替代原膀胱（n=7，第2组，B）；7只用组织工程膀胱（BAMG复合MSCs细胞）替代原膀胱(n=7， 第3组， C).替代膀胱用80 PGA910锁边缝合于三角区.从三角区将8F硅胶管逆行插入尿道.8F的耻骨上管由粘膜下隧道置于三角区.耻骨上管用40铬制肠线固定于浆膜层.缝合处各个象限均用永久缝线标记.新膀胱用网膜包裹.腹部切口用40PGA910线缝闭.术后4～7 d去尿道置管，术后4 d去除耻骨上管.
1.5 膀胱测压及放射造影 术后8，12 wk进行.膀胱测压由经尿道6F双腔尿管实施.膀胱排空后恒流注入预温的无菌生理盐水记录膀胱内压.直至最大流出压(LPP).膀胱容积(Volmax)， 膀胱顺应性（Volmax/LPP）均记录.然后进行膀胱造影.
2 结果
2.1 纤维镜观察 分离所得MSCs细胞贴壁后，在Olympus IX50倒置相差显微镜下观察为纺锤样细胞（Fig 1）.
图1 MSCs细胞形态（略）
Fig 1 Shape of the MSCs ×200（略）
2.2 膀胱测压结果 在保留三角区膀胱切除术后8，12 wk进行了膀胱测压显示，实施次全切除而又未进行重建的膀胱，其膀胱顺应性降低到原来顺应性的11%.组织工程膀胱修复术后的动物的膀胱顺应性(分别为原来的104%和107%) 则与自体原有膀胱的顺应性无明显区别.A组动物在经过膀胱次全切除术后，在观察期内仅能够维持22%的自体膀胱原有容量.在上述动物排尿次数明显增多.应用替代手术进行修复的动物，其膀胱容量分别恢复达到85% 和95%.
2.3 膀胱造影X线照片 在术前以及术后8，12 wk，进行了X线膀胱造影及超声检查.术后1 mo，造影显示所有动物膀胱均充盈.第一组动物的膀胱在整个研究期间，未能增加体积，而仅仅能够再生很小的储水能力(Ｆig 2).而组织工程膀胱在体积和轮廓上始终保持正常(Fig 3).
2.4 大体检查 在术后8，12 wk处死动物.在尸检过程中，内脏以及输尿管均未出现大体异常.重新找到膀胱，缝线标志着移植物与原有膀胱的分界.在第一组动物中，可见储水腔虽然很小，但正常.应用组织工程新生器官进行修复的动物尸检显示，在所有时间点，未发生上输尿管梗阻结石形成、硬壳或其他畸形等现象.在术后1 mo，被网膜包绕的再造膀胱内的BAMG已经肉眼难辨及触摸不到.再造的膀胱具有柔韧性和可膨胀的外部轮廓.在术后2 mo，临近的网膜可以在圆顶部通过钝性分离的方式使之与膀胱组织分开.在再造膀胱的外部有绒毛膜样层形成.起初放置的标志性缝线位于再造膀胱的远端，大约70%以上体积的再造膀胱组织位于标志性缝线的上部.进入再造膀胱的腹侧，自体膀胱与再造膀胱处，平滑的粘膜表面没有任何区别.
2.5 组织学 对A组的自体膀胱以及从B组、C组的轮廓过渡区和远端再造膀胱区的标本进行横切片.A组显示正常的组织学分布，带有肌肉肥大的征象，这可以通过计算机形态分析和免疫细胞化学染色得到证实.实验组再造的膀胱组织术后1 mo标本显示，膀胱内腔完全被膀胱上皮覆盖.2 mo时，B组在BAMG完全降解之前，平滑肌纤维已经呈现有机的空间排列，形成了各种各样大小的束状，但粘膜下肌层再生不完全.C组，BAMG完全降解，在新生膀胱的远端区域，显示了明显的三层结构，包括一层形态正常的膀胱上皮衬里覆盖在粘膜下层之上，随之是一层含有各种形状的平滑肌束.C组膀胱标本取材后经过HE染色证实与自体膀胱具有相同的正常组织学结构(Fig 4).
图2 A组膀胱再生很小的储水能力 （略）
Fig 2 All bladders in A group maintained normal shape（略）
图3 组织工程膀胱在体积和轮廓上始终保持正常 （略）
Fig 3 Shape of tissue engineered bladders maintained normal shape（略）
图4 HE染色C组显示了明显的3层结构（a），B组则粘膜下肌层再生不完全（b）（略）
Fig 4 C group showed a normal cellular organization consisting of a trilayer of urothelium， submucosa， and muscle (a)， the cystectomyonly controls prensented a pattern of normal urothelial cells with a thickened fiberotic submucosa and a thin layer of muscle fibers (b) HE ×100（略）
3 讨论
自胎儿时起，膀胱就暴露在各种可能的损伤之下.先天性畸形、癌症、外伤、感染、炎症、医源性损伤或其他一些可能的情况导致膀胱损害或缺失，最终需要膀胱代替或修复.目前，节段性胃肠组织常被用作膀胱的修复替代治疗.胃肠组织具有吸收功能，而膀胱是储尿排尿器官，因而术后可能发生众多的并发症：感染、代谢紊乱、尿石形成、穿孔、粘液形成增加以及恶性变［4-6］.由于胃肠组织修复受损的膀胱组织存在上述问题，许多研究人员试图应用自然或合成生物材料进行膀胱代替或修复.
1917年Neuhoff首次将筋膜用于狗膀胱扩大术.自此，用于膀胱替代实验研究和临床实践的生物材料越来越多，包括异体膀胱、心包膜、硬脑膜以及胎盘等［7］.已经在实验和临床应用的合成性材料包括乙烯聚合物海绵、聚四氟乙烯、胶原基质以及硅树脂等［8-10］.由于结构、机械、功能上或者生物相容性方面的问题，大多数上述材料在应用中均失败了.通常，永久性合成材料机械特性不能满足需要，而且易于形成输尿管结石.可降解生物材料易致纤维增生沉积、疤痕形成、移植物挛缩，随时间延长，膀胱内腔容积减小，影响功能.
胎盘膜和心包膜曾用于狗膀胱扩大术的实验研究［8］.功能上，植入组织至术后36 mo，显示了适当的能力，但是，存在缩小现象.组织学上，虽然存在上皮层，但缺乏肌层.异体膀胱组织最早在1961年用于实验研究［10-13］，最近已经被许多研究单位应用.在膀胱整复治疗中，作为无细胞膀胱移植物的众多不同材料，修复时，膀胱上皮层往往有能力正常再生，而肌层虽然存在，但往往发育不够完全［14，15］.我们的实验结果也表明提示膀胱上皮层再生较快，4 wk时各组已与正常上皮相同.而组织工程膀胱组逼尿肌及粘膜基肌层在受体兔仅获得部分再生替代，单用BAMG组仅见少量受体兔逼尿肌浸润.
单用BAMG材料即可获得完全的膀胱上皮再生，而自体膀胱上皮体外培养，扩增所需时间约为4 wk，所以我们构建组织工程膀胱时没有用自体膀胱上皮细胞，仅用3 wk时间分离、培养、扩增MSCs用于组织工程膀胱构建，缩短了构建周期.
报道单用BAMG进行膀胱切除修复实验，12 wk时逼尿肌及粘膜基肌层在受体兔获得完全替代［4］.我们的结果表明术后12 wk，组织工程膀胱组逼尿肌及粘膜基肌层在受体兔获得完全替代，而单用BAMG组逼尿肌及粘膜肌层在受体兔未获得完全替代.尽管12 wk时，两组膀胱的容量及顺应性无差别，但功能上组织工程膀胱组优于单用BAMG组.
从发育学上看，MSCs来源于中胚层，有向平滑肌细胞转化的能力.有实验提示MSCs能向平滑肌细胞转化［15］.我们用MSCs构建组织工程膀胱获取较好功能，提示在体MSCs能够向功能性平滑肌转化.
我们的实验结果表明，MSCs作为一种较理想的自体细胞来源，在新西兰兔模型上，用于自体组织工程膀胱构建，进行膀胱替代手术后，可获得满意膀胱功能.
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