作者：范亮 苗继延 郑志汉 樊代明 杨云生
【关键词】 十二指肠溃疡
关键词: 一氧化氮合酶;十二指肠溃疡;螺杆菌，幽门;免疫组织化学
摘 要:目的 研究一氧化氮合成酶（NOS，包括n-cNOS，e-cNOS）在Hp阳性的十二指肠溃疡（DU）组织中的表达及治疗前后的变化;探讨DU的发生与Hp感染的关系并对其疗效、预后提供参考依据. 方法 采用免疫组织化学方法对60例DU胃镜活检标本观察其NOS的表达，包括Hp阳性30例，Hp阴性19例，DU治疗前Hp阴性经治疗后仍为阴性3例，DU治疗前Hp阳性经治疗后转为阴性8例. 结果 Hp阳性的DU组织中NOS的阳性反应强度明显高于Hp阴性的DU组织［n-cNOS:P1 &<0.01vs Hp（-）.e-cNOS:P2 &<0.01vs Hp（-）］，治疗后Hp感染转阴者NOS的表达有不同程度的减低（n-cNOS:P1 &<0.01vs治疗前，e-cNOS:P2 &<0.05vs治疗前），而治疗后Hp感染仍为阳性者，则无差异. 结论 在Hp引起DU的发病机制中，NOS可能是其致病因素之一，根除Hp可使DU组织中NOS降低，NOS是否可作为一项DU疗效及预后的指标，值得进一步探讨.
Keywords:nitric oxide synthase;duodenal ulcer，helicobac-ter pylori;immunohistochemistry
Abstract:AIM To study the relationship between nitric ox-ids synthase（NOS）expression level and Helicobacter pylori（Hp）infection in patients with duodena1ulcer（DU）.METHODS NOS expressions were studied by immunohis-tochemical method.60cases of DU were pided into4groups:30cases of Hp positive patients（group A），19cases of Hp negative patients（group B），3cases of Hp positive pa-tients who were proved still Hp positive after treatment（group C），8case of Hp positive patients who were proved Hp negative after treatment（group D）.RESULTS NOS expression levels in Hp positive patients were significantly higher than those in Hp negative patients ［n-cNOS:P1 &<0.01vs Hp（-）.e-cNOS:P2 &<0.01vs Hp（-）］.In group C，the NOS expression level had no changes after treatment.In group D，the NOS expression decreased at different levels after treatment（n-cNOS:P1 &<0.01vs before treatment，e-cNOS:P2 &<0.05vs before treatment）.CONCLUSION NOS may play a role in the mechanism of DU caused by Hp infection.It is worthy of further study as to whether NOS can be used as some index in the dignosis and prognosis of DU.
0 引言
十二指肠溃疡（duodenal u1cer.DU）发病机制复杂，迄今尚未完全阐明.近年来多数学者认为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是引起DU的因素之一，流行病学调查结果亦支持这一结论［1］ .在Hp感染所引起的DU的发病机制中有无NO的参与，目前对此报道不多.为此，我们采用免疫组织化学方法检测了NOS（n-cNOS，e-cNOS）在Hp感染的DU组织中以及治疗前后表达的情况，为研究DU的发生与Hp的关系，并对其疗效、预后提供参考依据.
1 材料和方法
1.1 材料 病理标本取自第四军医大学西京医院病理科所存1995-08/1997-02胃镜检查活检标本共计60例，其中包括Hp（+）的DU边缘组织30例，Hp（-）的DU边缘组织19例;DU治疗前Hp（+）经过治疗后仍为Hp（+）的DU边缘组织3例，DU治疗前Hp（+）经治疗后转为Hp（-）的DU边缘组织8例.全部为石腊切片，全部切片经病理科高年资医师再次阅片重新确诊.DU患者治疗方法:po洛赛克（omeprazole-Astra）20mg，2次・d-1 ;阿莫西林（Amo）0.5g，3次・d-1 ，得乐冲剂（DeNo1）110mg，4次・d-1 疗程2～4wk，然后复查胃镜，并检测Hp.n-cNOS，e-cNOS兔抗人多克隆抗体（I抗）为美国Santa Curz生物公司产品;ABC试剂及生物素化羊抗兔IgG（Ⅱ抗）为华美生物工程公司产品;3’～6’一二氨基联苯胺（DAB）为瑞士Fluka公司产品.
1.2 方法 采用ABC免疫酶标记法［2］ ，抗血清（I抗）工作浓度为1∶50，用未免疫牛血清做阴性对照，以PBS代替一抗作空白对照.Hp检测方法，采用尿素酶法及组织学检测法，二者均为阳性方定为Hp感染阳性.NOS主要为胞质着色，偶有核着色，主要定位于粘膜内皮和血管周围，在固有层中也有部分着色（Fig1）.阳性反应按阳性细胞检出率及阳性反应强度两个指标进行半定量分析.反应强度按如下结果判定:无着色者为阴性（-），浅黄色为弱阳性（+），黄褐色为中度阴性（），深黄褐色为强阳性（）（Fig2）.按有阳性反应的例数计算阳性反应率.
图1 － 图2 略
统计学处理:采用计算机SAS6.11版数据系统， 阳性细胞检出率用四格表精确概率法，阳性反应强度采用等级资料进行检验，两组样本采用Wilcoxon等级资料比较，多组样本的两两比较的秩和检用Ne-menyi法.
2 结果
2.1 Hp阳性DU组织中n┐cNOS，e┐cNOS的表达 n-cNOS，e-cNOS在Hp（+）与Hp（-）的DU组织中阳性细胞检出率无差别（P1 =0.363，P2 =0.067）.反应强度比较:n-cNOS（u=3.039&>2.58，P1 &<0.01），e-cNOS（u=3.532&>2.58，P2 &<0.01）;即Hp（+）与Hp（-）的DU组织中的反应强度有显著差异，说明Hp（+）DU组织中e-cNOS，n-cNOS的反应强度明显高于Hp（-）的DU组织（Tab1）.
表1 Hp（+）DU组织中n-cNOS，e-cNOS的表达 略
2.2 Hp阳性DU治疗后n┐cNOS，e┐cNOS的表达 n-cNOS在治疗前后DU组织中的阳性细胞检出率有差异（P
1 =0.036），即在治疗前n-cNOS表达高，而在经过治疗后Hp感染转阴的溃疡组织中表达降低，e-cNOS则无差异（P2 =0.170）.阳性反应强度的比较:治疗前Hp（+）DU的n-cNOS反应强度与治疗后Hp转阴的DU的反应强度有显著差异（P&<0.01），即治疗后Hp感染转阴者n-cNOS的反应强度明显减轻;而治疗后Hp感染仍为阳性者，则无差异（P&>0.05）.治疗前Hp（+）Du的e-cNOS反应强度与治疗后Hp转阴的DU的反应强度有差异（P&<0.05），即治疗后Hp感染转阴者e-cNOS的反应强度有一定程度的降低，而治疗后Hp感染仍为阳性者，则无差异（P&>0.05，Tab2）.
3 讨论
1980年Furchgott和Zawad发现内皮细胞能释放一种舒血管因子（EDRF），但其结构和特性未得到证实，直到1987年Palmer等［2］ 和Igrro等［3］ 分别证实EDRF是一种气体物质 一氧化氮（NO）.NO是在左旋精氨酸在NO合成酶（NOS）的作用下生成的，根据NOS生物学特性可将其分为两种，一种是原生酶（cNOS），它有两种形式e-cNOS及n-cNOS，主要分布在内皮细胞、神经细胞、平滑肌细胞和血小板等，其活性受Ca2+ /CaM的调控，另一种是诱生酶（iNOS），主要分布在内皮细胞、吞噬细胞、肥大细胞及各种免疫细胞等，其酶的活性不依赖于Ca2+ /CaM的调控，但需要有诱导因子的存在［4-7］ .NO作为一种神经递质和信使分子，具有多种生理功能.在胃肠功能调节方面NO起着重要作用［8，9］ .一项体内研究发现，免疫系统中的NO在控制肿瘤生长中起重要作用［10］ .有报告提示NOS表达与肝癌的增殖凋亡有关，在肝癌的发生、发展中起重要作用［11］ .一项研究证实较高水平NOS的表达提示在肝炎后肝硬化恶性转化及肝癌的进展中一氧化氮的产生起一定的作用［12］ .另一项研究结果表明肝硬化大鼠胃肠道各段NOS表达是降低的［13］ .大鼠应激后胃粘膜血流量与血浆内一氧化氮（NO）较对照组有明显下降［14］ .NO具有扩张血管的作用，它可以通过增加胃粘膜的血流量来保护胃粘膜［15，16］ .作者另一研究结果提示［17］ ，在Hp促进胃癌发生的过程中，可能有NO的参与，在Hp感染阳性慢性胃炎的发生中NO发挥一定作用.有学者提出Hp感染与作为宿主部分免疫反应的反应氮类NO和过亚硝酸盐持续产物形成有关［18］ .近年来对消化性溃疡的病因和治疗的研究提示，十二指肠溃疡的发病不仅与胃酸相关，而且与Hp感染有关，乙酰胆碱、组氨和胃粘膜固有层的免疫细胞和血浆细胞传递到效应细胞，NO可能是介导免疫细胞和上皮细胞之间相互作用的因子［19］ .
表2 Hp（+）DU治疗后n-cNOS，e-cNOS的表达 略
我们采用免疫组织化学方法检测NOS（包括e-cNOS，n-cNOS，能与人组织反应的iNOS缺售）在Hp感染的十二指肠溃疡组织中及治疗前后的表达情况.结果显示n-cNOS，e-cNOS在Hp阳性的十二指肠溃疡组织与即Hp性的十二指肠溃疡组织中表达的阳性细胞检出率无差异，但反应强度均明显增强，表明在Hp引起十二指肠溃疡的发病机制中，NO可能是其致病因素之一.结果还显示经过治疗后Hp感染转阴的溃疡组织中n-cNOS的阳性细胞检出率降低，反应强度则明显降低，经过治疗Hp感染仍为阳性者，则无差异.经过治疗后Hp感染转阴的十二指肠溃疡组织中e-cNOS阳性反应强度有一定程度的降低，而经过治疗Hp感染仍为阳性者，则无差异.结果提示根除Hp可使十二指肠溃疡组织中NOS降低，即在体内亦可诱导酶的活性，而且主要是n-cNOS降低.其机制可能是:NO与细胞产生的O
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