作者：杨波，陈宝琦，王禾，邵晨，刘贺亮，秦荣良，袁建林，康福霞，邵国兴
【关键词】 前列腺肿瘤
【Abstract】AIM：To study the effects of tumor suppressor gene PTEN on human prostate cancer cell line PC3. METHODS: Cationic liposome LipofectAmine2000 was used to transfect retrovirus vector PbabePTENpuro containing PTEN and Pbabepuro into PTENdeficient prostate cancer cell line PC3 respectively， and then cell growth， adhesion， segregation， apoptosis， cell cycle and ultrastructure alteration in vitro were studied. RESULTS: After PTEN was transfected into PC3 and expressed， cell growth rate obviously slowed down and the growth inhibition rate was 83%. Adhesion rate dropped and cell segregated from matrix more easily. FCM showed a small apoptosis peak and an obvious G1 block in cell cycle and EMS showed that cells lost some malignant features in ultrastructure. CONCLUSION: PTEN can inhibit PC3 growth and adhesion in vitro and may play an important role in prostate cancer gene therapy.
【Keywords】 genes， suppressor， tumor; PTEN; prostatic neoplasms; PC3
【摘 要】目的： 研究抑癌基因PTEN对人前列腺癌细胞系PC3细胞生长、粘附、细胞周期、超微结构的影响.方法： 利用阳离子脂质体LipofectAmine 2000介导，分别将含PTEN的逆转录病毒载体PBabePTENpuro及空载体PBabepuro转入PC3细胞，观察转染前后细胞的生长、粘附、超微结构、细胞周期改变情况.结果： 将PTEN转入后，细胞生长明显受到抑制，生长抑制率为83%；同质型粘附率下降；细胞超微结构失去部分恶性表型特征；细胞周期由G1→S0期受抑制，并且出现一个小的凋亡峰.结论： PTEN可以明显的抑制PC3生长、粘附.因而PTEN可能会在前列腺癌基因治疗上起一定的作用.
【关键词】 基因，抑制，肿瘤；PTEN；前列腺肿瘤；PC3
0 引言
抑癌基因PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome， TEN），又称MMAC1/TEP1，在1997年被发现后，已在肿瘤研究中受到了积极的注意和极为广泛的研究.我们采用已知PTEN缺失的前列腺癌非雄激素依赖型细胞系PC3，利用脂质体转染法将PTEN导入PC3细胞，通过对细胞生长粘附及细胞周期、凋亡，超微结构等改变的观察，为今后进一步研究PTEN对前列腺癌的基因治疗提供依据.
1 材料和方法
1. 1 材料 PTEN载体PBabePTENPuro质粒及空载体PBabePuro质粒美国Frank Furrai博士惠赠，阳离子脂质体Lipofectin Amine2000 (Gibco)、嘌呤霉素购于Sigma公司，免疫组化、Western blot相关试剂及PTEN单抗鼠抗人）购于Santa Cruz公司，酶标二抗山羊抗鼠IgGHRP购于华美公司，质粒DNA抽提系统购于华舜公司.
1.2 方法
1.2.1 质粒DNA的扩增纯化 参照《Molecular Biology》制备感受态大肠杆菌株DH5α，质粒DNA转化细菌后，进行扩菌.分别采用碱裂解法，聚乙二醇法及华舜质粒DNA少量抽提系统提取纯化质粒DNA，上述提取获得的质粒DNA用紫外分光光度计测定纯度及浓度，保存备用.
1.2.2 细胞培养 前列腺癌细胞系PC3及DU145由陈宝琦副教授提供，培养基为含100 mL・L-1 FCS RPMI1640培养液.
1.2.3 阳离子脂质体介导的细胞转染及筛选 依照脂质体Lipofectin Amine 2000说明书操作， 选用Puromycin PC3 4 d致死最小剂量05 μg・mL-1为筛选浓度，维持筛选3～4 wk，出现阳性克隆13个，转染效率为43克隆/105细胞，撤药后常规用含100 mL・L-1 FCS的RPMI1640培养恢复4 wk，撤药后细胞逐渐死亡，由于未发现微生物污染等其他原因，参考其他相关文献，我们推测是由于PTEN对PC3抑制作用太强所致，因而考虑采用瞬时表达方法来观察PTEN对PC3的作用.转染后5 h，更换为含200 mL・L-1 FCS 的RPMI1640培养液恢复细胞约48 h， 25 g・L-1胰蛋白酶消化后用于以后的实验.
1.2.4 转染效果鉴定 我们选用免疫组织化学染色方法及Western Blot方法来鉴定转染效果，分别以前列腺癌细胞系PC3及已知表达PTEN蛋白的人前列腺癌细胞系DU145为阴性及阳性对照.具体方法参照PTEN单抗说明书.
1.2.5 转染前后细胞生长、粘附、细胞周期及超微结构改变情况 通过测定细胞生长曲线和粘附率实验及细胞分离实验观察转染前后细胞生长、粘附的改变情况；通过流式术及Gimsa染色观察细胞周期改变与凋亡情况；通过透射电子显微镜观察细胞超微结构变化及凋亡情况．
统计学处理：实验数据采用SPSS统计软件进行统计学处理，数据用x±s表示，统计方法采用方差分析.
2 结果
2.1 转染效果鉴定 Western Blot结果显示阳性对照组DU145细胞出现一特异性着色条带，瞬时转染组于同一分子量水平也出现一特异性着色条带，但弱于阳性对照组.免疫组织化学方法证实PTEN定位于细胞质内表达，阳性对照DU145细胞胞质内呈棕褐色着色，阴性对照组PC3细胞未见着色，瞬时转染组PC3细胞部分细胞胞质内棕褐色着色，部分细胞未见着色，证实PTEN成功转入PC3细胞并获得表达（Fig 1 A，B）.
A：Parent PC3 cells showed negative stain. SABC ×200； B：After PTEN transfection， PTEN stain can be seen in the cytoplasm of PC3 cells. SABC ×400
图1 免疫组化结果（略）
Fig 1 Immunohistochemistry result（略）
图3 Gimsa染色可见转染后出现较多的凋亡细胞（略）
Fig 3 The apoptosiss cells of the transfected PC3 cells showed by Gimsa stain（略）
A：The parent PC3 cells contained plenty organell and had a lots of irregular microvillus，also with a high proportion of nucleus to cytoplasm; B：After PTEN was transfected in， the PC3 cells showed opposite phenotype and had some apoptosis cells when compared to parent.
图4 电镜扫描结果（略）
Fig 4 The EMS results（略）
2.2 转染前后细胞生长、粘附、细胞周期及超微结构改变情况 细胞生长曲线测定：结果显示转染组生长受到明显的抑制与空载体组及亲本PC3细胞存在明显差异（P&<001，Fig 2），抑制率为83%.
△：Darent;■: Control; ◆:Transfectcd.
图2 细胞生长曲线（略）
Fig 2 Cell growth curve（略）
细胞同质型粘附率测定：结果显示PTEN转染组细胞粘附率3 h，6 h分别为（361±28）%和（611±56）%，空载体组分别为（547±23）%和（806±46）%，亲本细胞组分别为（530±05）%和（815±74）%，转染组细胞粘附率下降，与空载体组和亲本细胞组存在明显差异（P&<005）.
细胞分离实验：结果显示PTEN转染组细胞易脱落，在同一时间段内均与空载体组及亲本组PC3细胞存在显著差异（P&<005，Tab 1 ).
流式细胞仪结果显示：PTEN转入部分PC3细胞后出现一明显的凋亡峰，与亲本细胞PC3对照，细胞处于生长周期G1期比例上升S期比例下降，提示PTEN可通过诱使凋亡以抑制肿瘤细胞生长，同时使细胞停滞于G1期，即G1 block现象.
表1 细胞分离试验（略）
Tab 1 cell segregation test （略）
Gimsa染色可见转染后出现较多的凋亡细胞（Fig 3）.细胞透射电镜超微结构观察结果显示亲本PC3细胞核质比例较大，细胞器含量丰富，膜表面有数量多而不规则的微绒毛，部分细胞间有桥粒连接及内囊形成等腺癌特征，PTEN转入PC3细胞后细胞核质比例下降，细胞器含量下降，膜表面微绒毛数量少而规则并出现凋亡细胞及凋亡小体.细胞质内出现中等电子密度的颗粒样物质沉积提示PTEN转入后细胞失去部分恶性表型特征并出现凋亡（Fig 4 A，B）
前列腺癌是老年人最容易罹患的癌症，许多研究表明p21及p53基因的异常表达与前列腺癌的发病关系密切［1，2］，刘荣福等［3］研究表明p16基因与前列腺癌的发生发展密切相关，p16蛋白的检测可以作为判定前列腺癌预后的一个有用指标.这些研究为前列腺癌的基因治疗打下实验基础.而抑癌基因PTEN最初在人恶性胶质瘤细胞染色体改变分析中发现，后续研究发现它与多种恶性肿瘤有关，尤在前列腺癌、甲状腺癌等组织中有较频繁的突变或缺失，PTEN还与常染色体显性等位基因紊乱所致的某些癌前病变如Cowden病，LhermitleDuclos病及BannayanZonana综合征有关.
PTEN定位于人常染色体10q233，含9个外显子，由1212个碱基对构成，编码的功能蛋白质是一个由403个氨基酸残基组成的双特异性磷酸酯合成酶，与蛋白酪氨酸酶（PTP）有高度同源性.其磷酸酯合成酶结构域位于氨基酸序列末端，与PIclns 3，4，53磷酸酯合成酶类似，可拮抗PI3OH激酶活性.C端发生点突变可影响整个PTEN的稳定性，并可诱使其肿瘤抑制表型发生逆转［4］.
PTEN可抑制肿瘤细胞生长，侵袭，移动及灶性粘附，其生长抑制效应高于p53，其发生异常可能由于：① 杂合子缺失；② 无义突变；③ 某种形式的内部剪切异常；④ 启动子甲基化；⑤ 错义突变，致使PTEN蛋白表达水平下降或失表达，从而诱使肿瘤细胞生长加速、侵袭粘附移动能力加强，易于肿瘤发展.PTEN是Fas介导效应的关键性调质，参与Fas介导的凋亡过程中的PI3/Akt信号转导通路［5］.PTEN通过催化PtdIns 3激酶促使PtdIns(3，4，5)三磷酸降解，在1磷酸酰肌醇3激酶信号通路中起重要的调控作用，以抑制PtdIns3激酶信号通路介导的下激功能：蛋白激酶B活化、细胞生长、分化；PTEN负性调控灶性粘附过程，可直接去磷酸化和抑制FAK活性来降低肿瘤的粘附能力［6］.PTEN负性调控调节细胞移动速度的接合器蛋白Shc与丝裂原活化蛋白（MAP）激酶信号通路及调节细胞方向性运动的FAK及p130（cas）通路，并可直接使Shc去磷酸化，从而抑制肿瘤细胞的移动与侵袭［7］；PTEN可能通过抑制p27水平下降调节细胞生长周期，p27是G1 Cyclin依赖激酶的主要抑制剂，PTEN可诱使细胞由G0/G1期到S期转变停滞［8］.PTEN还抑制Intergrin介导的MAPK活化，从而抑制上述物质介导的细胞生长分化加强效应［9］.PTEN具特有的脂类磷酯酶活性可诱使细胞停滞于G1期并促进细胞凋亡.而且其作用机制与强力霉素引起的抑制肿瘤细胞生长、粘附、侵袭及转移的机制安全不同［10］.
PTEN在前列腺癌细胞系、裸鼠移植模型及组织中有较高频率的突变和缺失.此外，PTEN缺失多发生于进展期前列腺癌，在转移性前列腺癌中的突变率高于原发性前列腺癌，提示PTEN与前列腺癌的病理进展有关［11］，PTEN异常与前列腺癌Gleason积分（≥7分）相关，因此借助PTEN的失表达可以帮助前列腺癌的预后［12］.PTEN可通过抑制VEGF mRNA 来影响前列腺癌血管的生成，从而抑制前列腺癌的进展［13］.
本实验发现，当PTEN稳定转入PC3细胞后细胞生长受到强烈的抑制，用瞬时转染方法获得的细胞中有较高比例的转入细胞（免疫组化、Western blot证实）已表达PTEN蛋白，并且呈现出明显的生长抑制效应，同时细胞易脱落，对基质的同质型粘附率下降，并且细胞出现凋亡及G1/S比例上升的效应，超微结构也失去部分恶性肿瘤特征，提示PTEN对前列腺癌细胞系PC3具有明显的生长粘附抑制作用，这一抑制效应部分由凋亡引起，但由于凋亡所占的比例不足以解释PTEN所引起的全部肿瘤抑制效应，PTEN可能通过某种非凋亡死亡方式抑制PC3细胞的生长，本结果提示PTEN可能在前列腺癌的基因治疗中发挥一定的作用.
【参考文献】
［1］ Liu RF， Shao GX， Yang LJ， Wang H， Liu F， Chen BQ.The expression and correlation between gene p21 and gene p53 in human prostate carcinoma specimens［J］.Disi Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1999; 20(10): 932-933.
［2］ Yin JA， Liu F， Liu RF. Mutant p53 protein expressed in human prostate adencarcinoma specimens［J］.Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)， 1999; 20(8): 706-709.
［3］ Liu RF， Shao GX， Wang H， Chen BQ， Liu F.The relationship between the expression of tumor suppressor gene p16/MTS1 and biological behaviors in prostate carcinoma［J］.Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)，1999; 20(8): 692-695.
［4］ Georgescu MM， Kirsch KH， Akagi T， Shishido T， Hanafusa H. The tumorsuppressor activity of PTEN is regulated by its carboxylterminal region［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(18):10182-10187.
［5］ Di Cristofano A， Kotsi P， Peng YF， CordonCardo C， Elkon KB， Pandolfi PP. Impaired fas response and autoimmunity in PTEN(+/-)mice［J］. Science， 1999;285(5436):2122-2125.
［6］ Huang J， Kontos CD. Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation， migration， and survival by the tumor suppressor protein PTEN［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002 ;22(5):745-751.
［7］ Gu J， Tamura M， Pankov R， Danen EH， Takino T， Matsumoto K， Yamada KM. Shc and FAK differentially regulate cell motility and directionality modulated by PTEN［J］.J Cell Biol， 1999;146(2):389-403.
［8］ Zhu X， Kwon CH， Schlosshauer PW， Ellenson LH， Baker SJ. PTEN induces G(1) cell cycle arrest and decreases cyclin D3 levels in endometrial carcinoma cells［J］. Cancer Res， 2001;61(11):4569-4575.
［9］ Aikawa R， Nagai T， Kudoh S， Zou Y， Tanaka M， Tamura M， Akazawa H， Takano H， Nagai R， Komuro I. Integrins play a critical role in mechanical stressinduced p38 MAPK activation［J］. Hypertension， 2002;39(2):233-238.
［10］ Gao XK，Wang H， Wu GJ，Yang B. MMPs inhibitor doxycycline suppresses invasion of PC3 in vitro ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)，2002; 23(24): 2261-2264.
［11］ Pesche S， Latil A， Muzeau F， Cussenot O， Fournier G， Longy M， Eng C， Lidereau R. PTEN/MMAC1/TEP1 involvement in primary prostate cancers［J］. Oncogene， 1998;16(22):2879-2883.
［12］ McMenamin ME， Soung P， Perera S， Kaplan I， Loda M， Sellers WR. Loss of PTEN expression in paraffinembedded primary prostate cancer correlates with high Gleason Score and advanced stage［J］.Cancer Res， 1999;59(17):4291-4296.
［13］ Koul D， Shen R， Garyali A， Ke LD， Liu TJ， Yung WK. MMAC/PTEN tumor suppressor gene regulates vascular endothelial growth factormediated angiogenesis in prostate cancer［J］.Int J Oncol， 2002;21(3):469-475.