关于热刺激对原代培养神经元部分生物学特性的影响

【关键词】 神经元
　　【Abstract】 AIM: To study the effects of hyperthemia on the morphology and apoptosis of neurons， as well as the changes of neural vitality at different temperature. METHODS: The morphology of neurons was observed by microscope， their apoptosis was detected by Klenow method and the results were analyzed by image analysis system. The vitality of neurons was detected by MTT reduction assay. RESULTS: The average gray of Klenow positive cells increased with temperature and the highest average gray was 133.40±4.49 while the value of the control group was 69.54±2.70. The vitality of neurons decreased with temperature. CONCLUSION: Hyperthemia induces the apoptosis of neurons and 39℃ is the temperature to induce the peak point of apoptosis. The vitality of neurons decreases with the increase of temperature.
　　【Keywords】 hyperthermia; neuron; Klenow method; apoptosis
　　【摘要】 目的： 研究热刺激对神经元形态及凋亡的影响， 观察不同温度下神经元活力的变化. 方法： 利用倒置相差显微镜观察高温后神经元的形态学改变. 应用Klenow法对不同高温后神经元进行凋亡检测，应用图像分析仪对检测的结果进行分析. MTT法进行平均吸光度检测. 结果： 高温处理后神经元出现形态学改变. Klenow法检测发现未经高温处理的对照组神经元平均灰度为69.54±2.70，高温处理后平均灰度升高，39℃时达高峰133.40±4.49，而后随着温度升高，平均灰度逐渐降低. MTT法测定显示随着温度升高细胞活力逐渐降低. 结论： 高温处理神经元可诱导其凋亡，39℃时达高峰. 神经元细胞活力随温度升高而降低.
　　
　　【关键词】 高温；神经元；Klenow法；凋亡
　　0引言
　　热刺激是一种物理致伤因素，常是引起人类中暑、热痉挛、热衰竭等病症的重要因素. 其致损伤机制目前尚不清楚. 我们采用体外原代培养的神经元，模拟体内梯度高温环境，用倒置相差显微镜、Klenow原位杂交、MTT细胞活力测定技术，研究不同程度高温对体外原代培养神经元形态、活力及凋亡的影响.
　　1材料和方法
　　1.1材料① 动物：孕15 d昆明种二级孕鼠由第四军医大学实验动物中心提供（陕动字003号）. ② 主要试剂和仪器：胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM（Gibco公司），胰酶（华美公司）；DNA聚合酶ⅠKlenow片段介导的dATP生物素切口末端标记试剂盒（Oncogene）；MTT（华美公司）；真彩色图像分析仪（LeicaQ570 c）；全自动可调水浴加热器（第四军医大学教保处）.

　　1.2方法
　　1.2.1细胞培养取孕15 d昆明种二级孕鼠，引臼脱颈处死，消毒后，逐层剖开腹部，取出胎鼠，体视显微镜下分离胎鼠大脑脑泡外侧部的皮质. 剪碎脑组织，经125 mg・L-1胰酶消化，1000 r・min-1， 离心1 min， 终止消化，以完全培养基(10 mL・L-1胎牛血清，青、链霉素1×105 U・L-1)稀释至7×108・L-1密度并接种于经多聚赖氨酸处理过，加有玻片的培养皿及96孔板中，送 入50 mL・L-1 CO2的培养箱， 37.4℃培养48 h后，加入阿糖胞苷(10 mg・L-1)以抑制非神经元的继续生长，每隔2 d半量换液，培养第7日时，经βtubulin免疫荧光染色显示80%以上细胞为阳性，可认为是纯神经元培养，进行后续实验［1］.

　　1.2.2热应激损伤模型的建立培养好的神经元移入经乙醇消毒的全自动水浴加热器，处理30 min.

　　1.2.3实验分组将培养好的神经元随机分为高温组和对照组① 高温组：按高温模型分别于38， 39， 40， 41和42℃温度处理30 min. ② 对照组：37.4℃正常培养的神经元. 上述实验及对照组均随机选取3个细胞爬片.

　　1.2.4倒置相差显微镜观察在倒置显微镜下观察处理组及对照组皮质神经元的形态.

　　1.2.5DNA聚合酶ⅠKlenow片段介导的dATP生物素切口末端标记方法（Klenow法）处理组及对照组皮质神经元的细胞爬片，TBS洗后，蛋白激酶K处理. 30 mL・L-1 h3O2清除内源性酶，Klenow平衡缓冲液处理，Klenow标记反应混合物覆盖玻片，加入终止缓冲液，阻塞缓冲液，1X结合物，DAB显色，梯度乙醇脱水，树脂封片. 10×40光学显微镜下观察，细胞内有棕黄色颗粒者为阳性染色细胞.

　　1.2.6MTT比色法将培养于96孔板内的细胞按上述分组. 加入 MTT 20 μL，继续培养3~4 h. 吸去培养液，加入含40 mmol・L-1盐酸的异丙醇溶液，振荡5 min. 酶标仪上测定A490 nm.
　　1.2.7图像分析用LeicaQ570c真彩色图像分析仪对Klenow法检测的细胞玻片进行平均灰度检测，每张玻片随机选择5个视野进行检测. 设定黑为0，白为255，所得结果被255减后，进行统计学分析.

　　统计学处理：实验结果以x±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行方差分析，各组与对照组间比较采用Dunnettt检验.
　　2结果
　　2.1光镜观察在倒置显微镜下，正常神经细胞经胰蛋白酶消化后呈圆形. 接种培养后10 h，胞体增大呈圆形或椭圆形，分散的神经细胞开始贴壁. 16 h贴壁细胞增多并有突起长出，胞体呈梭形或三角形，双突起多见，突起末端可见生长锥. 24 h后大部分神经细胞贴壁，突起延长，开始相互连接. 3 d后细胞胞体进一步增大，突起继续增长，相互连接成神经网络. 7 d时对照组细胞光晕明显，胞体饱满并聚集成团，细胞团间有粗大的突起并相互连接，神经网络稠密. 处理组高温后漂浮细胞增加，神经细胞数目减少，神经网络稀疏，有的细胞突起漂浮，有的失去突起，呈圆形或椭圆形. 这种形态改变随温度越高越明显. 39℃时部分细胞坏死，胞体碎裂. 42℃大部分细胞出现坏死，胞体碎裂，突起漂浮或消失（Fig 1， 2）.

　　2.2DNA聚合酶ⅠKlenow片段介导的dATP生物素切口末端标记方法（Klenow法）检测 未经高温处理的对照组神经元经Klenow法检测的结果为69.54±2.70，39℃时达高峰，而后又逐渐降低. 经过方差分析，不同温度平均灰度不同（P&<0.01），各组与对照组比较有差异(Tab 1， Fig 3， 4).

　　2.3MTT结果随着温度的升高，平均吸光度下降. 经过方差分析，不同温度MTT吸光度不同（P&<0.01），各组与对照组比较有差异(Tab 1).
　　表1不同温度下Klenow染色阳性细胞平均灰度及MTT法的平均吸光度（略）
　　Tab 1The average gray of Klenow positive cells and absorbency of MTT at different temperature point(略)
　　3讨论
　　高温环境下，特别是机体对热适应反应尚未建立时，常导致热射病等疾病的发生，表现为中枢机能紊乱、水盐代谢失调、外周循环衰竭等临床表现，但其详细机制仍不清楚. 本实验我们采用体外原代培养的皮质神经元，能够在体外严格控制实验条件下观察干预因素对神经元的影响. 国内外学者在研究中发现，高温可诱导多种细胞凋亡［2，3］. 目前，凋亡研究中常用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL法）检测DNA损伤，该方法主要应用于DNA双链断裂的检测［4］. 1997年Tagaya等［5］发现应用DNA聚合酶ⅠKlenow片段介导的dATP生物素切口末端标记方法（Klenow法）可以检测到DNA损伤，并发现可以检测DNA单链及双链断裂. Jin和徐若华等［4，6］已经在大脑中动脉缺血再灌注模型上证明神经元缺血早期DNA单链损伤的存在，且为神经元的主要损伤形式. Clark等［7］应用Klenow方法在创伤性脑损伤的实验中也发现了DNA单链损伤，说明Klenow法检测DNA单链断裂的敏感性优于TUNEL法. 　　图139.0℃时神经元形态（略）
　　Fig 1Morphology of neurons at 39.0℃×400（略）
　　图237.4℃时神经元形态 （略）　　
　　Fig 2Morphology of neurons at 37.4℃×400（略）
　　图339.0℃时Klenow阳性细胞（略）
　　Fig 3Klenow positive neurons at 39.0℃×400（略）
　　
　　图437.4℃时Klenow阳性细胞（略）
　　Fig 4Klenow positive neurons at 37.4℃×400（略）
　　我们应用原代培养的皮质神经元，对其进行高温预处理，发现对照组神经元光晕明显，胞体饱满并聚集成团，细胞团间有粗大的突起并相互连接，神经网络稠密. 高温后漂浮细胞增加，神经细胞数目减少，神经网络稀疏，有的细胞突起漂浮，有的失去突起，呈圆形或椭圆形. 39℃时部分细胞坏死，胞体碎裂. 42℃大部分细胞出现坏死，胞体碎裂，突起漂浮或消失. Klenow法发现在未经高温处理的对照组神经元平均灰度为69.54±2.70，处理组平均灰度增加，到39℃时达高峰133.40±4.49，而后又逐渐降低，说明高温可诱发神经元凋亡，且在39℃时神经元凋亡最为明显. MoriyamaGonda等［8］对PC3前列腺癌细胞使用不同高温处理后，发现高温不仅可以诱发其凋亡，还可以导致其坏死，引起反应性氧自由基增加和超氧化物歧化酶的激活，这说明从凋亡到坏死的过程和高温或高温的持续时间有关. 我们的实验也发现高温后的神经元凋亡有一峰值，这可能与高温引起神经元坏死，细胞总数下降有关. Takasu等［2］的研究结果表明，热诱导HL60细胞凋亡过程中，凋亡率的升高伴发G1期细胞及S期细胞数量减少. Khan等［9］人发现有丝分裂期间的神经元比有丝分裂后的神经元对高温诱导的凋亡更加敏感. 有丝分裂期、G1期及S期细胞代谢旺盛、耗氧量高. 实验中我们发现，高温诱发神经元凋亡的温度较文献报道诱发肿瘤细胞低［2］，这可能与神经元需氧大，代谢旺盛，对生长环境要求严格有关. MTT结果发现随着温度的升高，平均吸光度下降，37.4℃为0.48±0.03，42℃为0.21±0.02. 从本实验结果可以看到高温处理后神经元的生物学特性有很大的变化，凋亡细胞增加，细胞活性随温度升高不断降低. 这种变化与温度的影响密切相关，证明了高温对神经元生物学特性的影响.
　　【参考文献】
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　　［3］ Lue YH， Lasley BL， Laughlin LS， Swerdloff RS， Hikim AP， Leung A， Overstreet JW， Wang C. Mild testicular hyperthermia induces profound transitional spermatogenic suppression through increased germ cell apoptosis in adult cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) ［J］. J Androl， 2002;23(6):799-805.
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　　［5］ Tagaya M， Liu KF， Copeland B， Seiffert D， Engler R， Garcia JH， Del Zoppo GJ. DNA scission after focal brain ischemia. Temporal differences in two species ［J］. Stroke， 1997;8(6):1245-1254.
　　［6］ Xu RH， Wan Q， Zhang W. In situ detection of neuron DNA strand early breaks using the Klenow fragment of DNA polymerase ［J］. Zhonghua Laonian Xinnao Xueguanbing Zazhi (Chin J Geriatric Cardiovasc Cerebrorasc Dis)， 2000;2 (4):266.
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　　［8］ MoriyamaGonda N， Igawa M， Shiina H， Urakami S， Shigeno K， Terashima M. Modulation of heatinduced cell death in PC3 prostate cancer cells by the antioxidant inhibitor diethyldithiocarbamate ［J］. BJU Int， 2002;90(3):317-325.
　　［9］ Khan VR， Brown IR.The effect of hyperthermia on the induction of cell death in brain， testis， and thymus of the adult and developing rat ［J］. Cell Stress Chaperones， 2002;7(1):73-90.转贴于