作者：姚立农，柴伟，赵晖，杨永慧
【关键词】 缺血再灌注损伤
【Abstract】 AIM: To establish a myocardial stunning model of isolated rat heart by the Langendorff apparatus and identify its reliability. METHODS: 30 rat hearts were infused by KH perfusion solution and were pided to 5 groups by different periods of myocardial ischemia. Myocardial contractile and diastolic functions were measured during experiment and the infarct size was analyzed by TTC staining after reperfusion. RESULTS: There were significant differences in the myocardial function among all the groups during reperfusion (P&<0.01) but the differences were not significant before ischemia. The infarct size was (2.2±3.4)%， (7.5±5.2)% and (9.0±4.8)% in the control group， 15 min ischemic group and 20 min ischemic group， respectively (P&>0.05). The infarct size was (21.7±5.5)% and (39.7±8.8)% in 25 min ischemic group and 30 min ischemic group， which were significant larger than that in the other three groups (P&<0.01). CONCLUSION: The myocardial stunning model established in isolated rat heart is reliable and a 20 min global ischemia is sufficient to induce myocardial stunning.
【Keywords】 ischemiareperfusion injury; myocardial stunning; rat
【摘要】 目的： 利用离体大鼠心脏建立心肌顿抑模型并进行可靠性分析. 方法： 以KH灌注液对30只离体大鼠心脏行Langendorff法灌注，根据缺血时间不同分为5组，测量缺血前后心室收缩和舒张功能的变化并于再灌注60 min后进行坏死面积分析. 结果： 各功能指标在缺血前无组间差别，缺血后差异明显（P&<0.01）. 非缺血组、缺血15 min组和缺血20 min组的坏死区比率分别是(2.2±3.4)%、(7.5±5.2)%和(9.0±4.8)%，两两间比较无明显差异（P&>0.05）. 缺血25 min和缺血30 min组的坏死区比率分别是(21.7±5.5)%和(39.7±8.8)%，明显高于前3组（P&<0.01）. 结论： 在离体灌注的大鼠心脏上建立的心肌顿抑模型是可靠的，全心肌常温缺血20 min仅造成心肌顿抑.
【关键词】 缺血再灌注损伤；心肌顿抑；大鼠
0引言
心肌顿抑是缺血再灌注损伤的一种常见形式，表现为可逆性的心肌收缩和舒张功能减弱. 为了研究各种干预措施对心肌顿抑的预防和治疗效果，我们根据不同时间缺血后再灌注损伤的特性，以心肌收缩和舒张功能及心肌坏死面积为指标，探索可靠、简便的心肌顿抑模型.
1材料和方法
1.1材料成年雄性Wistar大鼠30只，体质量325~350 g. KH灌注液含NaCl ，KCl ，MgSO4 ， Kh3PO4， NaHCO3， CaCl2和葡萄糖，分别为118.7， 4.7， 1.2， 0.95， 28.0， 1.3和10.0 mmol・L-1. 非循环的Langendorff灌注装置由氧合器、灌注浴槽、滚轴泵、加热水箱、储液器及连接软管等组成. 灌注液通过装有5 μm硝酸纤维滤过膜的滤过器注入氧合器，用950 mL・L-1 O2和50 mL・L-1 CO2预平衡至少30 min. 整个实验过程中灌注液保持37℃恒温，灌注压10.26 kPa (100 cmHO2)，停止灌注可形成全心肌缺血.
1.2方法① 离体心脏的制备：大鼠腹腔注射戊巴比妥钠60 mg・kg-1麻醉. 自股静脉注射肝素200 IU. 胸正中切口暴露心脏，横断各大血管，取出心脏立即置于冰浴的KH缓冲液中，剪除周围结缔组织，悬挂于非循环的Langendorff装置行主动脉逆行灌注. 上述操作在60 s内完成. 在右心房和左心室前壁分别置放钩状起搏电极，维持心率300 次・min-1; ② 实验分组：根据全心肌缺血时间的不同，30只大鼠随机分成5组(n=6)：非缺血组、缺血15 min组、缺血20 min组、缺血25 min组和缺血30 min组；③ 心肌功能测量：剪开左心房经二尖瓣置一聚乙烯球囊于左心室内，其末端连于压力传感器（Medex Medical Inc， Lancashire， UK）. 球囊的容积稍大于心室容积，调节球囊内盐水容量使左室舒张末压为0.68~1.08 kPa (5~8 mmHg)，并维持实验始终，避免球囊内混有气泡. 通过压力监视器（78534A， Hewlett Packard， Germany）持续监测左室压力变化，压力信号经数字转化器(analoguedigital converter ATMIO， National Instruments， Texas， USA)存入计算机. 每次测量记录4~8 s的压力信号，并经数据获取和分析软件（Nuffield department of anaesthetics）储存处理. 灌注稳定10 min后，测量左室收缩峰压（PSP）、左室舒张末压（EDP）、左室发展压DP（DP=PSPEDP）、左室收缩压最大上升速率（+dP/dtmax）、左室舒张压最大下降速率（-dP/dtmin）和冠脉流量作为基础值. 各组缺血后再灌注均为60 min，于再灌注10， 20， 30， 40， 50和60 min重复测量以上参数；④ 心肌坏死程度分析：心肌标本经染色进行坏死面积分析. 先将心脏标本置于-20℃冰箱冷冻约20 min，然后沿心脏横轴切成厚约1 mm的薄片. 将其置于10 g・L-1 TTC (Sigma Chemical Co， Dorset， UK) 磷酸缓冲液中(pH=7.4)，恒温37℃孵育20 min. 灰白色不着色组织为坏死区，砖红色为非坏死区. 染色后的标本在40 g・L-1的甲醛中浸泡24 h固定，用两块聚丙烯透明板压平，然后将标本和缺血区轮廓描出，用扫描成像系统(Desk Scan Ⅱ， version 2.3.1， Hewlett Packard， Germany)存入计算机，利用Sigmascan (Jandel Corporation， CA， USA)软件进行面积分析.
统计学处理： 数据用x±s表示. 用SPSS统计软件对坏死区比率进行单因素方差分析，两组间差异比较采用LSDt检验，心肌功能指标用重复测量方差分析以及LSDt检验.
2结果
缺血前后左室心肌功能的变化见Tab 1. 缺血显著降低室性收缩和舒张功能，表现为DP和dP/dt降低，EDP增高. 各功能指标在缺血前无组间差别，缺血后差异明显（P&<0.01），缺血时间越长，收缩和舒张功能降低得越明显. 5个缺血时间组间坏死区比率的差异有显著性（P&<0.01），非缺血组、缺血15 min组和缺血20 min组的坏死区比率分别是(2.2±3.4)%、(7.5±5.2)%和(9.0±4.8)%，两两间比较无明显差异（P&>0.05）. 随缺血时间延长坏死区逐渐扩大，以心内膜下的坏死为主要表现. 25 min或30 min的缺血后，每个心脏标本均出现坏死组织，坏死区比率分别是(21.7±5.5)%和(39.7±8.8)%，明显高于前3组，而缺血30 min组的坏死区比率也高于缺血25 min组（P&<0.01）.
表1各组心肌功能的变化（略）
Tab 1Changes of myocardial function among groups(略)
3讨论
3.1大鼠心脏适于离体灌注在各种实验动物中，大鼠离体心脏有独特优点：心脏体积适于离体灌注、手术操作简便、价格低廉，便于大量使用. 大鼠心脏与人体心脏大体结构基本一致，并且由于侧枝循环不丰富，不但适于全心肌缺血的研究，而且适于局部缺血的研究［1］. 用离体大鼠心脏还可排除麻醉药、神经、激素等影响心肌机械功能因素的干扰， 如急性缺血早期，下丘脑、垂体和肾上腺激素水平上升，儿茶酚胺升高加速脂肪酸代谢、引起低血钾，加重心肌缺血［2］. 此外，离体心脏收缩不受前负荷、后负荷和心率的影响. 在该模型心脏前负荷保持恒定，心率也可用电刺激维持稳定，这都是在体心脏所不能及的. 另一常用离体心脏灌注模型是“作功心脏(working heart)”，该模型比Langendorff模型更接近生理状态，但灌注系统较为复杂，而且顺行灌注时不易精确测量左室功能［3］.
3.3心脏缺血20 min引起心肌顿抑缺血时间不同引起明显不同的缺血再灌注损伤后果，长期缺血引起心肌坏死，短时间缺血引起心肌顿抑，但在离体心脏究竟多长时间缺血仅造成心肌顿抑？缺血损伤的程度可能与动物大小、缺血时间、温度、操作、装置、灌注压和实验设计有关. 早期认为离体大鼠心脏常温全心肌缺血20 min表现为可逆损伤，但未直接测量心肌组织的坏死程度［6］. Mosca等［7］用免疫组织化学的方法证实大鼠离体心脏缺血20 min后的坏死细胞数为(10.8±1.9)%，而同期非缺血对照组为(10.3±1.2)%，认为排除非生理条件的影响，缺血20 min本身并不引起对心肌组织的额外坏死. 本实验也证实缺血15 min和20 min并不引起比非缺血组更明显的组织坏死. 而且，缺血15 min和缺血20 min后的冠脉血流与非缺血组亦无明显不同，所以在本实验条件下全心肌缺血不超过20 min仅造成心肌顿抑. 为减轻离体灌注心脏心肌组织坏死的程度，应注意以下几个方面：① 由于心肌衰老性改变，老年大鼠心脏易出现坏死；② Ca2+过载是缺血再灌注坏死的主要因素，增加灌注液的Ca2+浓度可加剧坏死［8］；③ 高Na+可通过Na+ Ca2+交换增加细胞内Ca2+浓度；④ 无氧条件下，糖酵解是ATP的唯一来源，所以高浓度的葡萄糖有利于提供充足的能量底物减缓ATP耗竭. 但同时其代谢产物乳酸和氧自由基却加重缺血再灌注损伤［9］；⑤ 缺血后心肌灌注受损，高灌注压有利于组织灌注减少坏死；⑥ 缺血期间常出现缺血性挛缩，Langendorff模型中由于左室气囊的置入造成心肌过度伸展，可加剧坏死［10］. 心肌坏死是各种因素综合作用的结果，甚至与实验操作水平有关. 实验证明，利用Langendorff装置在大鼠心脏建立的心肌顿抑模型是可靠的，全心肌常温缺血20 min仅造成心肌顿抑，而不引起明显的心肌坏死. 该模型的建立将有助于心肌顿抑机制和防治的研究.
参考文献
［1］ Maxwell SR， Hearse DJ， Yellon DM. Species vareation in the coronary collateral circulation during regional myocardial ischaemia: A critical determinant of the rate of evolution and extent of myocardial infarction ［J］. Cardiovasc Res， 1987;21:737-741.
［2］ Charles CJ， Rogers SJ， Donald RA， Ikram H， Prickett T， Richards AM. Hypothalamopituitaryadrenal axis response to coronary artery embolization: An ovine model of acute myocardial infarction ［J］. J Endocrinol， 1997;152: 489-493.
［3］ Kligfield P， Horner H， Brachfeld N. Amodel of graded ischemia in the isolated perfused rat heart ［J］. J Appl Physiol， 1976; 40: 1004-1008.
［4］ Schlack W， Hollmann M， Stunneck J， Thamer V. Effects of halothane on myocadial reoxygenation injury in the isolated rat heart ［J］. Br J Anaesth， 1996; 76: 860-867.
［5］ Jia QH， Jia GL， Li XR， Mei QB. Colloidal lanthanum as a marker for ultrastructural changes of microvessels of stunned myocardium and protective effects of 1，4Dihydropyridines ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)， 1998; 19(4): 412-414.
［6］ Weiss RG， Kalil Filho R， Herskowite A， Chacko VP， Litt M， Stern MD， Gerstenblith G. Tricarboxylic acid cycle activity in postischemic rat hearts ［J］. Circulation， 1993; 87:270-282.
［7］ Mosca SM， Gelpi RJ， Milei J， Fernandez AG， Cingolani HE. Is stunning prevented by ischemic preconditioning ［J］? Mol Cell Biochem， 1998;186:123-129.
［8］ Tao L， Li Y， Gao F， Wang YM， Gong WQ. Protective effect of ischemic postconditioning on rabbit hearts with acute myocardial ischemia and reperfusion ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)， 2000; 21(6): S116-S118.
［9］ Opie LH. Aerobic && Anaerobic metabolism ［A］. In: The heart ［M］. 3rd end. Philadelphia: LippincottRaven Publishers. 1997: 295-296.
［10］ Wang ZR， Xia T， Ma SP， Ma XB， Chen XF， Li JC， Wang YH， Bao Z. Effects of huoxue tongmai tablet on ischemiareperfusion injury of myocardium in rats ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ)， 1999; 20(6): 503-505.