作者：俞英欣，万琪，张瑞国，孙文萍
【关键词】 脑缺血
【Abstract】 AIM: To study DNA singlestrand damage at different time points and expression of Bax in cortical neurons under ischemiclike conditions and to investigate the relationship of the expression of Bax and DNA singlestrand damage. METHODS: The expression of Bax was detected by flow cytometer in cortical neurons under ischemiclike conditions. The treated neurons were detected by Klenow method at different time point of reperfusion for the positive expression and a half quantitative analysis was made. RESULTS: 2 hours after reperfusion， the expression of Bax reached peak point and the positive neurons of Bax decreased with the increase of reperfusion time. The average gray of Klenow positive cells with no reperfusion was 72.4±1.0 and increased with the increase of reperfusion time. The highest average gray was 135.5±1.3 at 2 hour of reperfusion. The ratio of Bax positive cells was related to the average gray of Klenow positive cells. CONCLUSION: Under ischemiclike conditions， the expression of Bax reaches peak point 2 hours after reperfusion and so is the DNA singlestrand damage， suggesting that the expression of Bax may be related to the DNA singlestrand damage.
【Keywords】 cerebral ischemia; reperfusion; DNA singlestrand damage; Bax; Klenow method
【摘要】 目的： 研究神经元类缺血再灌注不同时间点DNA单链损伤和Bax的表达情况， 探讨神经元类缺血再灌注时DNA单链损伤与Bax表达的关系. 方法： 利用流式细胞仪对小鼠皮质神经元类缺血再灌注损伤后Bax的表达进行检测. 应用Klenow法对缺血再灌注各时间点培养的神经元DNA单链损伤进行检测和半定量分析. 结果： 类缺血处理后再灌注不同时间点Bax的表达不同，再灌注2 h最强，而后随着再灌注时间的延长Bax的表达下降. Klenow法检测发现未经缺血处理的对照组神经元平均灰度为72.4±1.0，到达2 h达高峰135.5±1.3，而后又逐渐降低. 再灌注不同时间点Bax表达的阳性率与Klenow法检测的平均灰度成线性相关. 结论： 神经元类缺血再灌注2 h为Bax表达和DNA单链损伤的高峰，提示DNA单链损伤与Bax的表达密切相关.
【关键词】 脑缺血；再灌注；DNA单链断裂； Bax； Klenow法
0引言
脑缺血损伤可引起神经细胞DNA损伤，Jin［1］和徐若华等［2］人已经在大脑中动脉缺血再灌注模型上证明神经元缺血早期DNA损伤主要以单链为主. 应用DNA聚合酶ⅠKlenow片段介导的dATP生物素切口末端标记方法（Klenow法）可以对DNA单链损伤进行标记，达到监测DNA单链损伤的目的，但该方法能否用于培养的神经元DNA单链损伤的检测，还未得到证明. 大量实验已经证明当DNA损伤时可以通过激活p53等过程［3］，最终引发神经元凋亡，在凋亡的进程中有一关键的家族Bcl2家族，其促凋亡成员Bax参与DNA损伤诱导的凋亡进程，p53使Bax表达增加［4］，随后线粒体细胞色素c释放，启动凋亡进程［5］. 那么DNA单链损伤是否也能够引起Bax的表达增加，启动凋亡进程，本实验基于以上考虑应用原代培养的小鼠皮质神经元，研究以上问题.
1材料和方法
1.1材料① 动物：孕15 d昆明种二级孕鼠由第四军医大学实验动物中心提供（陕动字003号）. ② 主要试剂和仪器：DNA聚合酶ⅠKlenow片段介导的dATP生物素切口末端标记试剂盒(Oncogene)， Bax抗体(中山公司). 荧光显微镜(Olympus)，流式细胞仪(美国Coulter公司).
1.2方法
1.2.1细胞培养孕15 d昆明种二级孕鼠，引臼脱颈处死，剖开腹部，取出胎鼠，分离胎鼠大脑脑泡外侧部的皮质，剪碎脑组织，胰酶消化，终止，以完全培养基稀释至7×108个・L-1，台盼蓝染色评估细胞活性，95%左右为存活细胞. 接种于经多聚赖氨酸处理过的加有玻片的培养皿和培养瓶中，送 入50 mL・L-1 CO2 的培养箱， 37℃，培养48 h后，加入阿糖胞苷(10 mg・L-1)以抑制非神经元的继续生长，每隔2 d半量换液，培养7 d后，可见典型的神经元.
1.2.2神经元鉴定培养第7日的神经元细胞爬片，40 g・L-1多聚甲醛固定，PBS洗后，加入βTubulin抗体和Gap43抗体染色. 二抗为FITC标记的，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察计数，每种抗体计数3张爬片.
1.2.3类缺血模型建立细胞培养基换为不含糖的人工脑脊液，温度保持在(37±2)℃，混合气体换为 含80 mL・L-1 CO2 的氮气［6］. 人工脑脊液配制其组成为(mmol・L-1)：NaCl 123， KCl 3.75， Kh3PO4 1.25 ，NaHCO3 26， MgCl2 1， CaCl2 2， pH 7.4.
1.2.4实验分组将培养好的细胞随机分为缺血组和对照组：① 缺血组，按类缺血模型处理30 min. 然后再换为完全培养基送入50 mL・L-1 CO2 的培养箱， 37℃， 30 min， 1， 2， 3， 6， 12和24 h取出； ② 对照组，未经缺血处理的细胞. 上述实验及对照组均随机选取3个细胞爬片.
1.2.5DNA聚合酶ⅠKlenow片段介导的dATP生物素切口末端标记方法（Klenow法）经类缺血再灌注处理的神经元细胞爬片，TBS洗后，蛋白激酶K， 30 mL・L-1 h3O2处理后，用lX Klenow平衡缓冲液处理，加入 Klenow标记反应混合物，后加入停止缓冲液、封闭缓冲液、1X 结合物，最后经 DAB显色、脱水、封片. 光学显微镜下观察，细胞内有棕黄色颗粒者为阳性染色细胞.
1.2.6图像分析LeicaQ570c真彩色图像分析仪对Klenow法检测的细胞爬片进行平均灰度检测，阳性者为棕褐色，设定黑O，白255，所得结果被255减后，进行统计学处理.
1.2.7流式细胞仪检测类缺血再灌注处理的培养瓶中的细胞用0.25 g・L-1的胰酶消化， PBS吹打，1000 r・min-1离心1 min，收集的细胞加入50 mg・L-1 Saponin (Sigma公司)打孔，应用FCM洗液洗后，加入Bax抗体1 h， 37℃，经FCM洗液洗后，离心，加入FITC标记二抗，经FCM洗液洗后，上机检测，每组选择3个.
统计学处理：实验结果以 x±s表示. Klenow法和流式细胞仪结果的各时间点采用方差分析进行研究，各组与对照比较采用Dunnettt检验. 流式细胞仪Bax阳性率与Klenow方法所得结果采用直线相关分析.
2结果
2.1βTubulin和Gap43染色βTubulin染色结果阳性率为（0.83±0.20）%，Gap43染色结果阳性率为（0.79±0.01）%.
2.2Klenow法检测 未经缺血处理的对照组细胞核染色以淡黄色为主（Fig 1），平均灰度为72.4±1.0，0.25， 0.5和1.0 h平均灰度差异并不显著，到2 h达高峰，细胞核浓缩凝集，多数被染为棕黄色（Fig 2），平均灰度为135.5±1.3，而后又逐渐降低，24 h稍有增高(Tab 1).
Fig 1Klenow method of control group in cortial neurons×200（略）
图2小鼠皮质神经元类缺血再灌注2 h Klenow法染色（略）
Fig 2Klenow method of experimental group in cortial neurons at two hours×200（略）
2.3流式细胞仪检测结果随着再灌注时间的延长，检测的阳性细胞比率明显增加，再灌注处理2 h达到高峰，再灌注3，6，12和24 h阳性细胞数减少明显. 直线相关分析发现Bax表达与Klenow法所得平均灰度成正相关（Pearson相关系数r=0.700， P&<0.01）.
表1流式细胞仪检测的类缺血再灌注不同时间点Bax阳性细胞百分率和Klenow法阳性细胞的平均灰度（略）
Tab 1Percent of Bax positive and average gray of Klenow positive cells at different time point after reperfusion by flow cytometer（略）
3讨论
脑缺血再灌注损伤后，在缺血半暗带神经元死亡形式主要是凋亡，凋亡的启动是神经元DNA的损伤. DNA主要损伤形式为：DNA单链损伤和DNA双链损伤. 目前，常用的检测DNA损伤的方法有脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL法），该方法主要应用于DNA双链断裂的检测，而且检测的DNA损伤时间较晚，而Jin［1］和徐若华等［2］人发现应用Klenow法可以在脑缺血再灌注损伤模型上检测到DNA单链损伤，其检测时间明显早于TUNEL法，同时Clark等［7］也应用Klenow方法在创伤性脑损伤的实验中发现了DNA单链损伤. 推断DNA单链损伤可能为早期的DNA损伤形式. 研究已经证明DNA损伤（该损伤主要为应用TUNEL检测到的DNA双链损伤）可以激活Bax表达和重新分布［8］，启动下游凋亡效应分子引起caspase级链反应引起凋亡，同时DNA损伤还可以激活DNA修复，修复失败的细胞也会发生凋亡［9］. 因为DNA单链损伤比DNA双链损伤有更多的修复机会，且为早期的DNA损伤形式. 是否DNA单链损伤也能够引起Bax表达，引发凋亡进程呢?值得深入研究. Bax属于Bcl2家族的促凋亡的成员，小鼠脑缺血处理30 min再灌注1~72 h，尾状核神经元Bax快速从胞质转位到线粒体［10］，小鼠纹状体注射海人草酸，该刺激与缺血缺氧相似，Bax蛋白重新分布，引起凋亡［8］. 既是Bax的表达、转位与神经元凋亡进程密切相关. 本试验主要探讨的正是DNA单链损伤与Bax的关系. 脑缺血可以引起神经元缺血缺氧损伤，应用Langmoen等建立的神经元类缺血模型，可以模拟脑缺血环境. 该模型主要应用更换培养基（换为无糖脑脊液）和培养气体（换为80 mL・L-1 CO2的氮气）来完成的. 对神经元进行类缺血再灌注处理后，再灌注不同时间点应用Klenow法和流式细胞仪对DNA单链损伤和Bax表达进行检测，发现再灌注2 h，DNA单链断裂和Bax的表达均为最高，后随着再灌注时间的延长逐渐下降. 直线相关分析发现Bax表达与Klenow法所得平均灰度成显著正相关，说明DNA单链损伤与Bax的表达密切相关. 由此结果推测DNA单链损伤可能引起Bax的表达，引发凋亡进程.
脑缺血再灌注损伤时，在缺血半暗带凋亡是神经元的主要死亡形式，如果能够在此进程中加以干预将有助于神经元存活，同时也为脑缺血疾病的治疗提供方法. 减少DNA损伤引起的Bax表达将是很好的方法，可以使DNA损伤获得更多的修复机会，减少脑缺血的损伤程度. 同时也可以看出，脑缺血损伤早期既有神经元的损伤，所以早期及时的治疗是非常必要的.
【参考文献】
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