作者：王宗仁，李晶华，肖铁卉，邵中军，马静，郑谨，马爱玲，龙铟，王文，李军昌
【关键词】 ，，芪丹通脉片
【Abstract】 AIM: To investigate the preventive effects of QiDanTongMai Tablet (QDTMT) on mouse acute infarction and its possible mechanism. METHODS: SD mice were pided into control group， infarction group， QDTMT max dose group and QDTMT min dose group randomly. Different concentrations of QDTMT were administered to the four groups at same dosage twice a day for fourteen days before ligation. Coronary artery was ligated to establish the infarction animal model. Immunohistochemistry methods were used to detect the expression of VEGF and bFGF. RESULTS: Compared with that of the infarction group， the concentration of CPK and LDH decreased in all the QDTMT groups ［LDH: (946±83) U・L-1， (754±75) U・L-1 vs (1582±90) U・L-1， (P&<0.01); CPK: (1135±69) U・L-1， (960±39) U・L-1 vs (1513±47) U・L-1， (P&<0.01)］. Infarction size in all the QDTMT groups decreased， and the left ventricular functions improved. QDTMT enhanced the expression of VEGF and bFGF. CONCLUSION: QiDanTongMai Tablet can prevent acute myocardial ischemia and enhance the expression of VEGF and bFGF.
【Keywords】 Qidantongmai tablet; VEGF; bFGF
【摘要】 目的：研究芪丹通脉片 (QDTMT)对大鼠急性心肌缺血预防作用及其可能作用机制. 方法： 采用SD大鼠为研究对象，随机分为假手术组、损伤组、QDTMT大剂量组、QDTMT小剂量组. 各组均用生理盐水配置等体积药液灌胃14 d，每日2次. 冠脉结扎方法制造心肌梗死动物模型，采用心肌酶谱、心梗面积来检测模型，免疫组织化学染色检测缺血心肌血管内皮生长因子(VEGF)、 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达. 结果： 与模型组相比，用药组大鼠血清肌酸激酶同工酶含量降低乳酸脱氢酶［LDH: （946±83） U・L-1， （754±75） U・L-1 vs （1582±90） U・L-1， （P&<0.01）; CPK: （1135±69） U・L-1， （960±39） U・L-1 vs （1513±47） U・L-1， （P&<0.01)］，心肌梗死面积缩小，VEGF，bFGF表达增加. 结论： QDTMT能够预防急性心肌缺血；刺激心肌分泌VEGF， bFGF可能是其重要的作用机制之一.
【关键词】 芪丹通脉片；血管内皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子
0引言
VEGF刺激内皮增殖、增强血管通透性，bFGF刺激内皮、SMC和成纤维细胞增生，二者可以协同刺激血管增生对抗组织缺血，也是基因治疗慢性心肌缺血的研究热点. 芪丹通脉片(QDTMT)是我们根据祖国传统医学理论建立起来的方剂，具有活血生肌、行气通脉、促进冠状动脉血管生成的作用. 但其机制尚不清楚. 我们对SD大鼠实施预防性给予QDTMT，观察血清心肌酶含量、心肌梗死面积以及bFGF， VEGF表达量，探讨QDTMT对急性心肌缺血的保护作用及其作用机制.
1材料和方法
1.1材料SD大鼠44只，雄性，体质量（220±30）g，第四军医大学实验动物中心提供. QDTMT：主要成分有黄芪、当归、丹参、红花、桂枝；提取清膏干粉，1 g干粉相当于2.86 g生药；西京医院提供. 抗VEGF， bFGF及DAB染色剂购于武汉博士德公司. 生物素标记羊抗兔抗体，ABC复合物(第四军医大学神经生物教研室提供).
1.2方法动物随机分为4组，每组12只. 各组体质量方差分析结果显示无差异. ① 手术对照组（假手术组，生理盐水3 mL・kg-1)；② 损伤组（心肌缺血模型组，生理盐水3 mL・kg-1)；③ QDTMT大剂量组（2.0 g・kg-1）；④ QDTMT小剂量组（1.0 g・kg-1）. 用生理盐水配置等体积药液并分别灌胃，2次・d-1，连续14 d. 末次给药1 h后，用戊巴比妥麻醉大鼠，气管插管，开胸，距冠状动脉出口5 mm处结扎冠状动脉左前降支（LAD），呼吸机维持呼吸. 2 h后左颈总动脉取血，测定CPK、乳酸脱氢酶(LDH)含量；后断头处死大鼠，将1/2标本立即采用N―BT染色法测定心肌梗死区面积，以梗死区占心室重量的百分比表示梗死面积（IS），观察心肌梗死程度. 另一半标本（30只大鼠）取梗死区与非梗死区交界处心肌组织4 mm×5 mm大小，生理盐水冲洗，40 g・L-1多聚甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋. 石蜡切片梯度脱蜡， 45 mL・L-1的h3O2室温封闭15 min；每张滴加1 g・100 mL-1胰蛋白酶50 μL，37℃消化30 min；20 mL・L-1正常羊血清28℃封闭20 min. PBS稀释一抗(bFGF1∶50， VEGF1∶100)，加一抗50 μL，阴性对照片加入等量的PBS. 湿盒孵育4℃过夜；滴加1∶200稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 50 μL，28℃孵育30 min；滴加ABC液8℃孵育30 min；DAB显色液50 μL，避光显色5～8 min. 各步骤之间PBS洗3次，每次5 min；自来水冲洗5 min终止显色；脱水、透明、树脂封片. bFGF， VEGF为细胞质棕黄色染色. 显微镜观察下根据免疫组化染色深度、范围对染色结果综合判断. 实验过程中，梗死组和低剂量组各有2只死亡.
统计学处理：结果采用x±s表示，采用SPSS软件进行非参数检验.
2结果
2.1血清心肌酶谱与心肌梗死面积（IS）实验过程中，梗死组和低剂量组各有2只死亡. 与对照组相比，LDH含量均增加，且具有显著性差异；与模型组相比LDH含量均减少，且具有显著性差异. 与对照组相比，血清肌酸磷酸激酶（CKC）在模型组和低剂量组均增加；与模型组相比各组CKC含量均减少，且有统计学意义. 与模型组相比QDTMT低剂量组和QDTMT高剂量组心梗面积均明显减小，差异具有统计学意义. 提示QDTMT可以减少缺血对心肌的损伤，具有保护作用(Tab 1).
表1QDTMT对急性心肌缺血大鼠心肌酶谱及心梗面积影响（略）
Tab 1Influence of QDTMT on myocardial muscle enzymes and infarction size(略)
图1急性心肌缺血VEGF的表达（略）
Fig 1VEGF expression of in acute myocardial infarction×400（略）
A: Model; B: QDTMTmin; C: QDTMTmax.
图2急性心肌缺血bFGF的表达（略）
Fig 2bFGF expression of in acute myocardial infarction×400（略）
A: Model; B: QDTMTmin; C: QDTMTmax.
2.2 心肌VEGF， bFGF表达假手术组两种因子均没有表达. 而在实施冠状动脉结扎术的各组中，VEGF， bFGF均有表达，而且面积广泛. 总体而言VEGF在QDTMT高剂量组表达量最多，低剂量组次之，损伤组表达最少(Fig 1)，提示QDTMT可以促进缺血心肌表达VEGF. VEGF表达强度与药物浓度有关系，随着药物浓度的增加，表达增多. 模型组bFGF表达最少，高剂量组表达最多(Fig 2).
缺血心肌侧支循环的建立主要有两个过程：血管增生和血管重构［1］. 增生有两种方式：毛细血管生成和血管形成，前者指在已存在的血管上，以出芽的方式长出新的毛细血管，该过程依赖于内皮细胞的有丝分裂. VEGF与bFGF均能特异地作用于血管内皮细胞，刺激其增殖，促进血管形成，从而改善组织器官的血液供应［2-4］.
缺氧是刺激VEGF表达的重要因素［5］. Tomanek等［6］发现缺血缺氧均可诱导心肌细胞表达VEGF，而且坏死区明显高于非坏死区，另外低氧情况下培养心肌细胞，也可诱导VEGF表达增强. Grasselli等［7］进行了冠脉结扎和离体灌流实验也发现同样的现象，并发现了VEGF与bFGF的协同作用. Jih等［8］用狗做成AMI模型后，冠状动脉内注射bFGF 1 wk，发现bFGF可明显减少梗死面积. 可见bFGF也是一种对抗缺血的重要分子.
可以上调VEGF， bFGF表达的药物有血管紧张素Ⅱ、雌二醇、cAMP、cGMP等，但由于这些物质在体内代谢特点，无法作为一种有效的药物. 转基因治疗就目前研究进展而言也很难在近几年用于人体治疗. 因此寻找能促进VEGF表达药物的研究也非常重要. 本次研究发现VEGF在未缺血的对照组没有表达，而在缺血的各组均有表达，与文献报道一致. 高剂量组VEGF表达最多，低剂量组次之，模型组表达最少. 说明芪丹通脉片可以促进缺血心肌表达VEGF，来对抗缺血缺氧状态.
既往实验均已证明QDTMT具有益气活血、温通经脉、活血化瘀功效［9， 10］. 本次研究是在长期使用小剂量中成药的基础上进行的急性心肌梗死的实验研究，如果本方剂在人体也能有类似的作用，就有可能取代具有预防心肌梗死作用的阿斯匹林等西药，提高安全性. 但是复方中药成分多，作用机制复杂，就本次研究而言，QDTMT改善左室功能等其他功效，就不能对其促进VEGF、bFGF表达这一机制进行解释了. QDTMT对心肌缺血的保护机制的研究还有待于深入研究.
【参考文献】
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