作者：彭磊 王臻 王庆良 王鹏飞 胡蕴玉 吴银松
【关键词】 骨肉瘤
关键词: 骨肉瘤;T淋巴细胞，细胞毒性;体外扩增
摘 要:目的 研究骨肉瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外扩增培养的方法，并进行细胞毒检测. 方法 抽取骨肉瘤患者自身的外周血，分离淋巴细胞，用IL-2体外短期刺激方法提高对骨肉瘤细胞的免疫性，再按一定比例体外与多西紫杉醇处理的骨肉瘤细胞及巨噬细胞混合培养（MTLC）可获得骨肉瘤的特异性CTL细胞，进行鉴定并观察其杀伤特性. 结果 混合培养4d后，即可扩增出大量淋巴细胞，流式细胞仪证实主要是CD8+ 细胞，这些具有杀伤活性的CTL细胞体外对自身肿瘤细胞有很强的细胞毒作用. 结论 在IL-2作用下，应用巨噬细胞、自体肿瘤细胞及淋巴细胞体外混合培养，是体外扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞的较好方法，CTL作为新的特异性免疫治疗方法有望提高骨肉瘤的免疫治疗效果.
Keywords:osteosarcoma;CTL;proliferation in vitro
Abstract:AIM To induce the osteosarcoma specific CTL proliferation in vitro.METHODS We isolated T lympho-cytes from peripheral blood of osteosarcoma cases，which were previously dealt with docitaxol，and activated with com-bination of macrophages and interleukin-2（IL-2），then their tumor-killing ability was measured.RESULTS A large number of lymphocytes that proliferated after3d mixed cul-com ture were proved mainly to be CD8+ T cell by FCM，and their tumor-killing ability was great in vitro.CONCLUSION The specific CTL proliferation in vitro by mixed culture of macrophages，host tumor cells and lymphocytes under the presence of IL-2is a prospective way in the immunological therapy of tumor.It may improve the therapeutic effect of osteosarcoma.
0 引言
免疫治疗是恶性肿瘤治疗的重要辅助方法，已确认机体免疫监视功能中起重要作用的是细胞免疫，其中起特异性杀伤作用的是细胞毒T淋巴细胞（CTL），CTL具有特异性高、杀伤性强等特点，故有重要的临床应用前景，成为新的研究热点，但此研究在骨恶性肿瘤尚属起步阶段.我们应用自建系的骨肉瘤细胞系PL-992与患者自身淋巴细胞及巨噬细胞体外混合培养（MTLC），扩增出大量淋巴细胞，并对这些淋巴细胞进行生物学特性测定.
1 材料和方法
1.1 骨肉瘤细胞系PL┐991来源及预处理 手术无菌切除新鲜活力好的骨肉瘤组织，病理诊断为骨肉瘤骨母细胞型，接种裸鼠皮下，待肿瘤长出后，组织块培养法，体外传代建系并进行生物学特性测定.用6mg L-1 多西紫杉醇处理48h后与淋巴细胞体外混合培养.
1.2 自体淋巴细胞的分离 抽取骨肉瘤患者外周血4mL，淋巴细胞分离液（购于Sigma公司）1500g离心15min，分离淋巴细胞（1×106 ），培养于200mL L-1 小牛血清RPMI1640的完全培养液中.
1.3 特异性杀伤性T淋巴细胞的体外刺激诱导 用班蟊液获得患者自体的巨噬细胞加入用IL-2（上海华新生物高技术公司）150U mL-1 ，植物血凝素预刺激36h的淋巴细胞，同时加入1/8的多西紫杉醇处理的骨肉瘤细胞PL-991，37℃50mL L-1 CO2 条件下培养，细胞计数，并在倒置显微镜下观察.
1.4 流式细胞仪增殖T淋巴细胞检测 取2×106 mL-1 待测细胞加入U型孔内，再加入CD3+ CD4+ CD8+ 单抗，每孔各20μg，4℃孵育30min，应用免疫荧光和流式细胞仪测定淋巴细胞CD3+ +CD4+ +CD8+ 表型.
1.5 细胞毒活性检测 采用51 Cr释放法，取对数生长期的PL-992骨肉瘤细胞为靶细胞，密度为107 mL-1 ，加入（51 Cr）Na2 CrO3 70kBq mL-1 ，37℃孵育1h，PBS洗涤2遍后，按104 /孔加入96孔板，按不同的效靶比加入T细胞，培育4h后收集上清液作γ计数，自然释放孔为仅加入靶细胞，最大释放孔为靶细胞加入100μL NP40.
细胞毒计算公式为:细胞毒活性=（实验孔CMP-自然孔CMP）/（最大释放孔CMP-自然孔CMP）×100%.实验孔均设三复孔.
2 结果
2.1 形态学观察 应用倒置显微镜观察，细胞体积明显变大，共孵后体积增大2～3倍，呈圆形、多边形、新月形、三角形等多种不规则形态，以肿瘤细胞为中心，形成特异性淋巴细胞增值克隆，在倒置显微镜下呈葡萄状排列，并且细胞数量逐渐增多，4d后细胞串开始脱落，肿瘤细胞已经发生凋亡（Fig1）.
图1 诱导前后CTL细胞形态，诱导后细胞多样并可见肿瘤细胞的凋亡 略
2.2 细胞生长曲线 淋巴细胞加入肿瘤细胞后生长迅速，继而细胞数量迅速增加由1.6×106 增至第5日1.5×107 （Fig2）.
图2 CTL细胞增殖迅速 略
2.3 流式细胞仪测定 淋巴细胞CD4+ （17.0±1.1）%，CD8+ 占（76.0±5.3）%，CD3+ 占（84.0±2.4）%，CD8+ CD3+ 占（67.0±2.1）%证实为特异性淋巴细胞为主.
2.4 特异性杀伤性T淋巴细胞细胞毒活性 诱导出的CTL对自体骨肉瘤细胞的细胞毒活性，培养诱导的细胞毒性T淋巴细胞对自体骨肉瘤细胞的杀伤活性为84.3%与未诱导的T淋巴细胞有显著性差异（P&<0.01），提示细胞毒性T淋巴细胞有高效特异杀伤活性（Fig3）.
体外诱导肿瘤特异性CTL并作为新的过继性免疫治疗的活性细胞已成为近年来肿瘤治疗研究中的一个新的热点，特别是由CTL筛选肿瘤的特异性抗原作为肿瘤疫苗有广阔的应用前景，与黑色素瘤等免疫原性肿瘤不同，骨肉瘤的特异性抗原至今仍难定义［1］ ，因此设想直接用处理的肿瘤细胞刺激诱导CTL较为困难，但是国外有应用树突状细胞刺激诱导出肿瘤特异性CTL细胞的研究基础，巨噬细胞也同属于肿瘤抗原提呈细胞，对肿瘤抗原有一定的提呈功能.另外，活化巨噬细胞分泌多种因子，有利于淋巴细胞识别肿瘤抗原，MHC I，II抗原表达增强，膜表面TNF IL-1，IL-7表达增强［2，3］ .体内实验也证明，杀伤肿瘤细胞时巨噬细胞的浸润要早于T淋巴细胞，在肿瘤原位也找不到活化迹象，在引流淋巴结处T细胞有明显的活化，增殖巨噬细胞处理抗原，提呈抗原，导致肿瘤特异性T细胞活化［4-6］ .因此，我们采用巨噬细胞，处理的肿瘤细胞以及淋巴细胞体外混合培养，借助这两方面的理论基础，设想在体外模拟T细胞特异性激活的过程，诱导特异性的CTL.我们发现，应用巨噬细胞体外刺激淋巴细胞，T淋巴细胞体外扩增的速度明显快于既往作者的扩增速度，巨噬细胞提取方法简便宜行，使用价值较大［7-9］ .另外，我们还发现共孵后巨噬细胞的吞噬功能明显增强（另文报道），说明体内巨噬细胞与淋巴细胞有协同作用.
图3 略
总之，巨噬细胞与淋巴细胞共培养是一种较好的体外扩增特异性T淋巴细胞的方法，对于研究体内特异性淋巴细胞的转归及机制有重要价值，同时也说明了骨肉瘤的抗原性较强，肿瘤特异性淋巴细胞体外 回输的方法具有杀伤性强，特异性高等特点，有望提高骨肉瘤免疫治疗的结果，故有着重要的临床应用前景，值得深入研究.
参考文献
［1］Weiss A，Littman DR.Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus ［J］.Cell，1994;76（2）:263-274.
［2］Kawakami Y，Rosenber SA.Int Angiogenesis and cancer ［J］.Rev Immunol，1997;14（23）:173-192.
［3］Hanagiri T，Yoshino Itakenoyama M.In induction of cytokine production ［J］.Jpn J Cancer Res，1998;89:193-198.
［4］Takeuchi S.Hum tumor angiogenesis and model if metasisin pa-tient with cancer ［J］.Cell，1996;9（1）:1-10.
［5］Fenton RT，Sznol M，Luste DG.A recombinant human angio-statin protein inhabits experimental ［J］.Hum GeneTher，1995;6（1）:87-106.
［6］Shen F，Wang H，Xie TP.Experiment and clinical research of hepatuma specitific lymphocyte ［J］.Chin J Surg，1997;35:95-99.
［7］Merchant RE，Baldwin NG，Rice CD，Gein CL.Editing of mor-billivirus P gene in animal ［J］.J Neurol Res，1997;19（2）:145-152.
［8］Yang M，Cao YX，Liu ZG，Yao LB，Liu XP，Su CZ.Gastric carcinoma specific transfer factor induced IL-2receptor expres-sion on ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（1）:69-71.
［9］Han WN，Jin BQ，Ja Wei，Liu XS，Li Qi，Dong BQ.The effect of JM acute T leukemia cell line derived suppressor factor on apoptosis and cell cycle of T cells in vitro ［J］.Di-si Junyi Dax-ue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;20（1）:268-274.
［10］Gu JW，Zhang X，Chi SM，Li X，Fei Z，Zhang WH，Du L.Ex-pression and secretion of interleukin-8in pituitary adenoma cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;20（9）:1076-1083.
［11］Ge Nl，Ye SL.Study of the T lymphocyte antitumor ［J］.Guowai Yixue Zhongliuxue Fence（Foreign Med Sci Sect Oncol），1999;20（3）:134-137.