作者：范熙明 张惠中 张明华 范清宇
【关键词】 成骨肉瘤
关键词: Stathmin基因;反义核酸;成骨肉瘤;细胞系
摘 要:目的 探讨Stathmin基因的反义核酸（AS-ODN）对人成骨肉瘤细胞系的生长抑制作用，并观察与化疗药物合用后的协同作用. 方法 以高表达Stathmin的人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607为靶细胞、反义Stathmin（AS-ODN）为阻断剂，通过MTT试验观察AS-ODN对成骨肉瘤细胞的生长抑制作用及与紫杉醇（PTX）的协同作用，流式细胞仪分析细胞增殖周期的影响. 结果 AS-ODN及AS-ODN与PTX联合应用均明显抑制成骨肉瘤细胞的生长（P&<0.05，P&<0.01）.SOSP-9607在AS-ODN作用下，细胞分裂阻滞在分裂期的中期，并诱导细胞发生凋亡. 结论 Stathmin基因的反义核酸（AS-ODN）对成骨肉瘤细胞的生长可能起十分重要的作用，它有望成为成骨肉瘤治疗的新靶点，与抗癌药联合应用有协同作用.
Keywords:Stathmin gene;antisense oligonucleotide（AS-ODN）;osteosarcoma;cell line
Abstract:AIM To investigate the inhibition of AS-ODN of Stathmin gene on cultured human osteosarcoma cell lines and to observe the synergistic action when combined with anti-cancer chemical drugs.METHODS Human osteosarcoma cell lines SOSP-9607，with high expression of stathmin，were used as target cells and AS-ODN for blocking agent，to ob-serve the inhibitory effects of AS-ODN as cultured human osteosarcoma cell lines and the synergistic action when com-bined with Paclitaxel by using MTT method.The influence of cellproliferation cycle were analyzed with flow cytometer.RESULTS The growth of osteosarcoma cells were sup-pressed by AS-ODN（P&<0.05）and union of AS-ODN with Paclitaxel（P&<0.01）.Under action of AS-ODN，the cell di-vision was blocked in metaphase and cell apoptosis was in┐duced.CONCLUSION The AS-ODN of Stathmin gene may play a crucial role in the growth of osteosarcoma cells，it may be the new target of treatment to osteosarcoma and have the synergistic action with other anti-cancer chemical drugs.
0 引言
成骨肉瘤（osteosarcoma）是人类常见的原发性恶性骨肿瘤，死亡率和致残率很高［1］ .成骨肉瘤的发生可能为多重染色体畸变的结果［2］ ，最终导致癌基因激活或抗癌基因失活，两者均导致细胞生长调节控制信号的紊乱.正是由于这些关键性基因的差异表达导致了骨肉瘤细胞分化的失控.Stathmin（又称为op18，p18，p19，Prosolin及Metablastin）为一种高度保守的细胞内蛋白.Wallon等［3］ 认为抑制Stathmin的活性对细胞纺垂体形成至关重要，从而起到抑制细胞生长作用，阻断Stathmin的生物学功能有可能成为肿瘤治疗的重要措施之一［4］ .我们用人工合成的互补于Stathmin基因的反义核酸（AS-ODN），阻断Stathmin高表达的人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607，探讨对其生长抑制作用，并证实Stathmin基因AS-ODN与紫杉醇（paclitaxel，PTX）化疗药合用的协同抗肿瘤作用.为临床更有效治疗成骨肉瘤提供理论和实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料 人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607为本研究所建立［5］ .反义Stathmin核酸（AS-ODN）及用于对照的正义S-ODN合成于上海博亚生物技术有限公司，基因序列全硫代修饰:S-OND:5’-ATG-GCTTCTTCTGATATCCAGG-3’;AS-OND:5’-CCTGGATATCAGAAGAAGCCAT-3’.台盼蓝为上海化学试剂分装厂分装.紫杉醇由北京益普四环医药公司提供.
1.2 方法
1.2.1 MTT试验（测定AS-ODN及AS-ODN与PTX联合应用对SOSP-9607细胞生长的抑制作用） 取对数生长期的SOSP-9607细胞，调节细胞密度为5×107 L-1 各取0.2mL加入96孔板中，分别标记正义组，反义组，及联合用药组.正义组和反义组分别加入终浓度均为20μmol L-1 的S-ODN和AS-ODN;联合用药组加入终浓度为0.1μmol L
-1 的PTX和同上终浓度的AS-ODN，每组设3个复孔，培养后1，2，3和4d进行台盼蓝染色细胞计数，计算生长抑制率［（对照组细胞数一处理组细胞数）/对照组细胞数］.
1.2.2 流式细胞仪分析 流式细胞仪（FCM）分析采用Nicolletti氏法.将终浓度为20μmol L-1 的S-ODN和AS-ODN与SOSP-9607细胞共同培养3d后，离心去培养液，DBS洗涤2次，0.2mL PBS重悬SOSP-9607细胞，用吸管快速吹打进预冷的700mL L-1 乙醇中，4℃保存，检测前离心去乙醇，碘化丙啶染色15min，上机检测.所用流式细胞仪为Epics Elite（美国），汞激光激发波长为488nm.结果分析软件为Elite4.0和DNA Multictycle.
统计学处理:数据以x ±s表示，显著性差异采用t，χ2 检验.
2 结果
与正义组相比，反义组及联合用药组对SOSP-9607细胞生长均具有明显的抑制作用，联合用药抑制作用更明显，统计分析有显著性差异（P&<0.05，P&<0.01）.联合用药组抑制率明显高于单独用药（反义组）（P&<0.05，Tab1，Fig1）.
表1 不同时间药物对SOSP-9607细胞生长的影响 略
图1 用药后细胞生长曲线 略
细胞周期分布分析:AS-ODN（20μmol L-1 ）处理细胞3h后，可见细胞G2 /M期百分比增高;至48h，G2 /M期百分比达55.5%.亚二倍体峰（sub-G1 ）表示DNA降解，又称细胞凋亡峰，在72h，Sub-G1 期细胞占9.2%，提示细胞凋亡发生（Tab2）.S-ODN（20μmol L-1 ）处理组未见出现亚二倍体峰.
表2 AS-ODN（20μmol L-1 ）处理SOSP-9607细胞不同时间的DNA含量 略
3 讨论
反义基因疗法是目前肿瘤基因治疗中的一个重要方面，它是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，以其阻断瘤细胞内的异常传导信号，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡［6］ .成骨肉瘤是常见的恶性骨肿瘤，预后较差.目前对于成骨肉瘤的基础研究及临床治疗仍是当今医学领域热点之一.
图2 RT-PCR检测Stathmin基因表达 略
细胞周期分布分析，AS-ODN作用后首先表现为G2 /M期的阻滞，在G1 峰前出现凋亡小峰（AP峰）随后G2 /M逐渐减少，AP逐渐增多.AP峰的出现表明细胞DNA降解、渗漏，导致DNA染色能力下降，提示凋亡的发生.此结果表明，AS-ODN对SOSP-9607的生长抑制作用可能与其诱导肿瘤细胞凋亡有关.这一现象是否与Stathmin基因具有抑制凋亡作用有关，还是与其他的凋亡抑制基因或诱导基因有关，以及它们在信号传导中的联系，尚待进一步研究.
PTX是作用于微管/微管蛋白系统，抑制微管功能，使纺垂体失去正常功能的抗癌药.应用反义核酸抑制Stathmin表达与PTX为同一分裂途径上不同位点的作用.本实验结果说明:AS-ODN与PTX合用后的细胞生长抑制率较单独应用AS-ODN有明显提高，说明Stathmin AS-ODN与PTX有协同抗肿 瘤效应.我们设计的AS-ODN片段，互补于Stath-min RNA模板区，通过阻断Stathmin是其在转录和翻译过程中发生障碍，从而抑制SOSP-9607细胞的生长.有关Stathmin基因反义核酸对成骨肉瘤细胞作用的研究，国内尚未见报道.本实验结果说明，Stathmin基因反义核酸能有效地抑制肿瘤细胞的生长，为开发成骨肉瘤生物治疗提供了实验基础.我们认为Stathmin基因是成骨肉瘤治疗的新靶点，应进一步探索其中的机制，为成骨肉瘤的治疗提供新的线索.
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