关于RP┐HPLC法检测海马脑片灌流液中氨基酸类神经递质

　　　　　　 作者：王晓菲　罗晓星　周四元　赵德化　程涛　潘小军

【关键词】 谷氨酸
　　关键词: 高效液相色谱;海马;天门冬氨酸;谷氨酸;牛磺酸;γ-氨基丁酸
　　
　　摘 要:目的 建立一种可同时测定微量谷氨酸（Glu），天门冬氨酸（Asp），牛磺酸（Tau），γ-氨基丁酸（GABA）4种氨基酸类神经递质的HPLC分析方法. 方法 制备大鼠海马脑片，灌流取样，冻干再溶后，采用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生，反相梯度洗脱的高效液相/荧光检测法，测定其中4种微量氨基酸的含量. 结果 各氨基酸的浓度与峰面积均呈现良好的线性关系，相关系数（r）分别为:Asp0.9920，Glu0.9667，Tau0.9803和GABA0.9584;日内变异系数（%）为Glu4.3，Asp4.6，Tau6.7和GABA7.1;最低检出限（pmol L-1 ）为:Asp0.17，Glu0.35，Tau0.68和GABA1.12，标准加入回收率（%）分别为:Asp106±7，Glu101±5，Tau94±6和GABA92±11. 结论 该法具有衍生化反应操作简便，流动相成本低，灵敏度高，特异性强，分析时间短的优点，而且同样适用于其他生物样品的测定.
　　
　　Keywords:HPLC;hippocampus;aspartic acid;glulamate;taurine;GABA
　　
　　Abstract:AIM To establish a method for simultaneous de-termination of trace amino acid neu
rotransmitters Glu，Asp，Tau and GABA by HPLC was improved.METHODS The sample prepared by rat hippocampal slices perfusation was lyophi-lized and resoluted，4kinds of trace amino acids were determinated by HPLC which involved pre-column derivatiza-tion with o-phthalaldehyde，reversed-phase gradient elution and fluorescence detection.RESULTS A good linear rela-tionship existed between peak area and concentration of amino acids.The correlation coefficients（r）were:Asp0.9920，Glu0.9667，Tau0.9803and GABA0.9584respec-tively.The precisions（%）were Glu4.3，Asp4.6，Tau6.7and GABA7.1for interassay CV.The detection limits（pmol L-1 ）were:Asp0.17，Glu0.35，Tau0.68，GABA1.12and the recovery rates of4amino acids（%）were Asp106±7，Glu101±5，Tau94±6and GABA92±11respec┐tively.CONCLUSION The operation of the derivatization is easy，the mobile-phase is cheap and this method has suffi-cient sensitivity，specificity and less separation time.Also it is good for determination of amino acid in other biologic sam-ple.
　　
　　0 引言
　　
　　谷氨酸（Glu）、天门冬氨酸（Asp）、γ-氨基丁酸（GABA）和牛磺酸（Tau），是大脑海马结构中分布最广泛研究最多的神经递质，前两者属于兴奋性递质，后两者属于抑制性递质.这些氨基酸类递质的异常是诱发多种神经系统疾病，如兴奋性毒性反应、癫痫、舞蹈病、帕金森病的因素之一［1，2］ .随着对神经药理学研究的深入和临床神经系统疾病病因的探索，要求建立一种快速、精确的微量氨基酸定量分析方法.经典的氨基酸分离方法是离子交换色谱法［3］ ，此法需特殊装置，且分析时间较长;而荧光分光光度法和氨基酸自动分析仪检测灵敏度较低，且干扰因素较多［4］ .我们以大鼠的海马脑片灌流液为标本，以邻苯二甲醛为柱前衍生剂，建立起一种更简便、更灵敏，适于检测生物样品中微量氨基酸的高效液相色谱分析方法.
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 美国Agilent-1100系列高效液相色谱仪及荧光检测器，梯度设置及数据均由on-line计算机数据处理系统处理.邻苯二甲醛（OPA），2-巯基乙醇，L-Glu，GABA，Asp，Tau及乙醇胺均购自Sigma公司.甲醇为色谱纯（进口）.其余试剂均为分析纯（国产）.试剂用水为三蒸水.
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 色谱条件 色谱柱为Hypesil ODS柱（4.6mm×100mm，粒径5μm），流动相包括:甲醇和乙酸钠（0.1mol L-1 ，用冰醋酸将pH值精确调至5.52），流速0.9mL min-1 ，柱温:30℃，荧光检测激发波长为340nm，发射波长为455nm.三步梯度洗脱步骤为:①甲醇250～430mL L-1 ，1min;②甲醇430～700mL L-1 ，10min;③甲醇700～900mL L-1 ，1min;维持甲醇固定比率900mL L-1 ，1min;最后，甲醇由900～250mL L-1 返回，1min，总洗脱时间为15min.
　　
　　1.2.2 标准曲线的制备 准确称取Glu，GABA，Asp，Tau标准品，用0.05mol L-1 NaHCO3 溶液配制成不同浓度的标准品，分装，-20℃保存，待测.
　　
　　1.2.3 生物样品的收集和预处理 SD大鼠（♂，250～350g，一级动物，第四军医大学实验动物中心提供）断头取脑，在冰台上迅速解剖出海马，沿海马长轴手动切制脑片，厚度:200～400μm.放入自制灌流器中进行灌流.灌流介质为Kreb液，配比（mmol L-1 ）:NaCl117，KCl3.6，NaH 2 PO4 1.2，MgCl2 1.2，CaCl2 2.5，NaHCO3 25，Glucose11.5.持续通入混合气（O2 950mL L-1 ，CO2 50mL L-1 ）恒温37℃，恒速0.4mL min-1 ，灌流器容积0.5mL，可容纳5片脑片.灌流方向由底向上.将恒流0.4mL min-1 的灌流液每3min收集一个样本（1.2mL）.样品在-20℃可保存数月，为增加其敏感性.样品可低温冻干，用时用400μL水再溶，低温离心，取上清液备用.
　　
　　1.2.4 柱前衍生 5mg（OPA）溶于100μL甲醇中，加入5μL2-巯基乙醇，再用硼砂-氢氧化钠缓冲液（0.4mol L-1 ，pH9.5）稀释至5mL，配制成衍生化溶液（含OPA7.5mmol L-1 ），24h后使用.取标准液或处理后样品30μL，加入2倍体积的OPA液在室温下反应，精确记时在微型混合器上混匀30s，静置1min后立即进样，每次进样20μL.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 色谱图 在选定的色谱条件下，经15min梯度 洗脱，可得各氨基酸分离峰，海马脑片灌流液样品分离效果令人满意（Fig1，2）.
　　
　　图1 － 图2 略
　　
　　2.2 回归方程和最低检出限 以浓度（X）为横坐标，待测组分的峰面积与相应内标物的峰面积比值（Y）为纵坐标制作标准曲线.所得各氨基酸的线性回归方程分别为:Asp Y=1.942+0.127X（r=0.9920）;Glu Y=1.559+0.104X（r=0.9667）;Tau Y=2.959+0.222X（r=0.9803）;GABA Y=0.607+0.046X（r=0.9584）;当信噪比为3 1时，4种氨基酸的最低检出限分别为:（pmol L-1 ）:Asp0.17，Glu0.35，Tau0.68，GABA1.12（n=8）.
　　
　　2.3 标准品加入回收率和精密度 向海马灌流液样品中加入一定量的氨基酸混合标准品，利用增量法计算该方法的回收率（%）分别为:Asp106±7，Glu101±5，Tau94±6，GABA92±11.为考察方法的重现性，对同一样品同日内重复测定5次，不同日内重复测定5次，获得日内变异系数（%）为Glu4.3，Asp4.6，Tau6.7，GABA7.1;日间变异系数（%）为Glu6.1，Asp6.9，Tau7.2，GABA8.6.
　　
　　2.4 样品分析 依1，2，3制备的样品测定得出正常大鼠海马脑片灌流液中氨基酸的释放量［pmol min-1 mg-1 ，x ±s，n=8］为:Asp3.07±0.63;Glu8.57±0.95;Tau4.06±0.76;GABA1.53±1.08.
　　
　　3 讨论
　　
　　海马脑组织切片具有独特而简单的三层结构皮层、明确而完整的神经回路及主要细胞类型较少的特点，是进行神经药理学研究的常用标本［1］ .兴奋性神经递质Glu，Asp与抑制性神经递质GABA，Tau的含量变化及二者比例的改变是研究神经系统疾病常用的重要生化指标.这些氨基酸往往不具有紫外吸收，也不发射荧光.因此，需将它们转变为能被检测的高灵敏度衍生化产物.OPA是目前应用最广泛的柱前衍生化试剂，反应迅速，而且剩余物质不干扰分离和检测.衍生化合物选用荧光检测器，较紫外检测的灵敏度大大提高［5，6］ .

　　我们首次利用此种分析方法对脑片组织灌流液中的微量氨基酸成分进行测定，首先优选了色谱条件:提高缓冲液中Na+ 浓度，可增强氨基酸衍生物的疏水性，使各相邻色谱峰之间保留时间的差值拉大，有利分离，所以我们选择乙酸钠作为流动相成分［7］ ;在实验过程中发现，流动相的离子浓度和pH值对分辨率及分析结果有较大影响（荧光物的荧光效率与pH值有关）.分别用不同离子浓度不同pH值的乙酸钠缓冲液作为流动相，优化出最佳的流动相为0.01mmol L-1 ，pH5.52，流速为0.9mL min-1 ，可得到良好的响应和检测灵敏度，减少并肩峰的出现;对激发波长和发射波长分别进行光谱扫描和等吸收图谱，获得最佳的Ex=340nm，Em=455nm;由于氨基酸相对分子质量差别较大，性质各异，采用梯度洗脱法可以大大提高分离效率，缩短分离周期［8］ .我们采用三步线性梯度洗脱程序并应用固定比率，分离效果较理想，与

参考文献

［8-11］相比，分离周期大大缩短（15min），洗脱时间稳定，重复性好;衍生化反应的关键是必须保证OPA的浓度高于试样浓度的200倍，否则会出现非线性的响应，而且OPA衍生化反应不稳定，受反应时间、反应温度以及光线的影响，因此应精确地控制反应时间为1.5min，严格控制反应 条件（28℃，避光）对得到合适的响应和良好的线性关系同样重要.
　　
　　我们采用OPA为柱前衍生剂，配合优选的内标物乙醇胺，改良建立了一种适于检测此类样本中的4种氨基酸类神经递质的高效、稳定、简便、快捷的HPLC梯度洗脱分析方法.该法色谱条件简便，灵敏度高，分离周期短，对其他生物样本也适用，可满足临床和科学实验的检测要求，应用前景广泛.
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