作者：张勇 曾维政 蒋明德 陈晓斌 徐辉 陈虹彬
【关键词】 胃肿瘤，
关键词: 螺杆菌，幽门;cagA基因;胃肿瘤
摘 要:目的 了解胃癌组织HpcagA基因感染状况，探讨HpcagA基因与胃癌的关系. 方法 采用Warthin-Starry银染和原位PCR方法，检测慢性浅表性胃炎（CSG）35例、慢性萎缩性胃炎（CAG）40例和胃癌（CG）35例的胃粘膜Hp及cagA基因感染状况.观察非癌患者胃粘膜炎症反应程度. 结果 慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、癌组织、癌旁胃粘膜组织Hp检出率分别为57%，62%，0%和54%;cagA基因检出率分别为20%，50%，29%和46%，萎缩性胃炎、癌旁组cagA基因检出率显著高于浅表性胃炎组（P&<0.01）.非癌患者胃粘膜单个核细胞、分叶核细胞浸润程度cagA+ 组较cagA- 组、Hp+ 组较Hp- 组显著增多（P&<0.01），且cagA+ 组还较Hp+ 组明显增多（P&<0.05）. 结论 萎缩性胃炎、胃癌患者cagA菌株感染率显著高于慢性浅表性胃炎组.cagA菌株引起更严重的炎症反应.说明HpcagA菌株感染与萎缩性胃炎、胃癌关糸密切.
Keywords:Helicobacter pylori;cagA gene;stomach neo-plasms
Abstract:AIM To examine Helicobacter pylori（Hp）cagA gene infection in gastric cancer tissues so as to study the rela-tionship between Hp cagA gene and gastric cancer.METHODS Warthin-Starry silver staining was used to de-tect Hp，in situ polymerase chain reaction（PCR）to detect
Hp cagA gene infection in gastric mucosa from35cases of chronic superficial gastritis，40cases of chronic atrophic gas-tritis，35cases of gastric carcinoma.Histopathological study was obtained to evaluate the level of inflammatory response in the cases without gastric carcinoma.RESULTS The Hp infection rates were57%in chronic superficial gastritis，62%in chronic atrophic gastritis，0%in carcinoma tissue，54%in gastric mucosa beside carcinoma tissue.The rates of HpcagA gene infection were20%in chronic superficial gastritis，50%in chronic atrophic gastritis，29%in carcinoma tissue，46%in gastric mucosa beside carcinoma tissue.In regard to Hpca-gA gene infection，a significant difference was observed bet-ween chronic superficial gastritis and chronic atrophic gastri-tis，gastric cancer（P&<0.01）.In the cases without gastric carcinoma，higher scores of mononuclear and polymorphonu-clear cells in gastric mucosa were observed in cagA
+ group than in cagA- group（P&<0.01），and in cagA+ group than in Hp+ group（P&<0.05）.CONCLUSION A significant higher cagA infection can be observed in chronic atrophic gastritis，gastric cancer than in chronic superficial gastritis.HpcagA genotype can cause a more significant inflammatory response and this aspect emphasizes the role of cagA genotype in the genesis of the tumor.
0 引言
流行病学、临床病理对照及幽门螺杆菌（Hp）对体外细胞的作用等研究显示Hp与胃癌关系密切［1-3］ .单纯Hp感染致沙土鼠胃腺癌的证据进一步明确了Hp与胃癌的关系.世界卫生组织国际癌症研究机构将Hp作为一类致癌因子.世界上40%～70%的人群感染Hp，仅少部分发展为胃癌.除胃癌的发生是多因素、多种致病因子长期作用、慢性发展的过程外，一个重要的因素可能是Hp菌株不同而产生的毒素因子不同，从而造成不同的临床结果.研究表明含cagA基因的Hp菌株均为高毒菌株，与胃癌及癌前疾病关糸可能更为密切［3］ .我们采用原位PCR技术检测胃癌组织中HpcagA基因表达状况，探讨HpcagA菌株与胃癌的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 我院1998年胃镜活检及手术切除胃粘膜标本110例，其中手术标本25例，均取自胃癌患者，分为3组:慢性浅表性胃炎组（CSG）、慢性萎缩性胃炎组（CAG）、胃癌组（GC）.诊断均经病理检查证实.各组患者一般情况见Tab1.胃粘膜标本均在胃窦部及胃体部取材2，3块.癌旁组织取材处距癌变病灶3cm以上.
表1 患者的一般情况 略
1.2 方法
1.2.1 Warthin-Starry银染检测Hp感染率 标本经40g・L-1 甲醛固定，常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化;醋酸缓冲液漂洗，10g・L-1 硝酸银、55℃孵育30min;50g・L-1 明胶、30g・L-1 对苯二酚和20g・L
-1 硝酸银混合液55℃显色数分钟，脱水、二甲苯透明，中性树胶封片.镜下见到典型的呈短棒状或螺旋形染成棕黑色认为Hp阳性.
1.2.2 原位PCR扩增检测cagA基因感染率 HpcagA基因引物序列由中国人民解放军军事医学科学院二所合成.引物序列:引物1:5’-ATAATGC-TAAATTAGACAACTTGAGCGA-3’;引物2:5’-TTAGAATAATCAACAAACATCACGCCAT-3’.标本经40g・L-1 甲醛固定，常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.2mmol・L-1 HCl酸化，1mg・L-1 蛋白酶K消化，RNA酶消化，40g・L-1 多聚甲醛固定.PCR扩增:在10μL/张切片的反应液中，含4mmol・L-1 MgCl2 ，400μmol・L-1 dNTPs，其中1/4dUTP由Bio-11-dUTP取代，1U Taq酶，cagA基因引物各2mg・L-1 ，加盖硅化玻片，指甲油密封.热循环条件:94℃预变性5min;94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环;72℃10min延伸.检测:30g・L-1 BSA封闭1h，AV-AP37℃30min，BCIP和NBT显色，核固红复染，紫蓝色颗粒为阳性.分别以无Bio-11-dUTP，无Taq酶及无引物条件作为阴性对照.
1.2.3 胃粘膜炎症反应 CSG，CAG组标本常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察炎症程度.根据悉尼胃炎分类系统及全国慢性胃炎共识［4］ ，将单个核细胞、分叶核细胞浸润程度分为四级并积分.单个核细胞，无:0分，即每高倍视野&<5个;轻度:1分，即单个核细胞较少，不超过粘膜层的1/3;中度:2分，单个核细胞较密集，超过粘膜层1/3，达到2/3;重度:3分，单个核细胞密集，占据粘膜全层.分叶核细胞，无:0分，粘膜层无分叶核细胞浸润;轻度:1分，粘膜固有层少数分叶核细胞浸润;中度:2分，分叶核细胞较多存在于粘膜层，并在表面上皮细胞间、小凹上皮细胞或腺管上皮间可见;重度:3分，分叶核细胞较密集或除中度以外还见小凹脓肿.比较cagA+ ，cagA- ，Hp+ ，Hp- 各组间组织炎症反应差异.
统计学处理:各组Hp感染率及cagA基因感染率用百分数表示，进行χ2 检验.组织学炎性细胞积分采用x ±s表示，进行u检验.
2 结果
2.1 各组Hp及cagA基因感染情况 银染方法检测Hp感染率在CSG，CAG及癌旁组间无显著差别（P&>0.05，Tab2）.cagA基因感染率在CAG及癌旁组显著高于CSG组（P&<0.01），前两者间无显著差异（P&>0.05）.
表2 Hp及cagA基因感染率 略
在CSG，CAG及癌旁组织中cagA基因分布于胃腺腔、粘膜上皮细胞表面和胞质阳性信号为紫蓝色颗粒（Fig1，2），胃癌及癌旁组织除上述分布外5例呈胞核阳性.慢性萎缩性胃炎组中6例伴肠化，3例不典型增生，仅1例肠化、Hp及cagA阴性，余Hp及cagA均为阳性.
2.2 慢性胃炎胃粘膜组织炎性细胞浸润情况 单个核细胞、分叶核细胞浸润程度cagA+ 组较cagA- 组，Hp
+ 组较Hp- 组显著增多（P&<0.01，Tab3），且cagA+ 组还较Hp+ 组明显增多（P&<0.05）.
图1 癌旁组织上皮细胞胞质、胞核cagA基因表达 略
图2 慢性萎缩性胃炎组织上皮细胞胞质cagA基因表达 略
3 讨论
国外一些研究发现，cagA基因株均为高毒菌株，与胃癌及癌前疾病关系密切［3］ .Kuiper等发现cagA抗体阳性组萎缩性胃炎发生率为62.0%，阴性组为32.0%（P=0.02），前者发生萎缩和肠化的相对危险度OR值分别为10.5和6.0.cagA-IgG阳性患者其萎缩性胃炎发生率显著增加，且其胃粘膜炎症反应、上皮细胞损伤程度更为显著［5］ .本结果显示，CAG组胃粘膜组织中cagA基因感染率明显高于CSG组，且cagA基因感染能使胃粘膜分叶核细胞、单核细胞浸润明显增多，与上述结果类似.这可能由于 cagA基因编码的一种表面蛋白具有很强的免疫源性，能诱导宿主胃粘膜局部产生多种细胞因子，尤其是IL-8及TNF-α，进而通过促进中性粒细胞的聚集和活化启动炎症过程，引起上皮细胞损伤.欧洲和北美地区胃癌与cagA+ 菌株感染密切相关.Parsonnet比较cagA+ 与cagA- 菌株，前者发生肠型胃癌的OR值为3.7.亚洲地区绝大多数Hp菌株属cagA+ ，似乎cagA+ 菌株在亚太地区没有太多的临床意义［4］ .然而国内的一些资料仍显示cagA+ 菌株与胃癌等疾病相关［6，7］ .这种差异可能与cagA基因有4种不同的亚型有关，而cagA基因的C亚型与萎缩性胃炎和胃癌关系密切［8］ .张沥等［9］ 对胃癌高发的西安地区大样本血清流行病学研究显示，该地区自然人群Hp感染率为54.1%，其中cagA+ 菌株占23.2%.而萎缩性胃炎、十二指肠溃疡、胃溃疡、胃癌组cagA+ 菌株感染率分别为87.6%，92.0%，86.0%和84.6%，显著高于慢性浅表性胃炎组65.6%.本结果显示cagA基因感染率在CAG、癌旁组织中显著高于CSG组.说明成都地区cagA
+ 菌株感染与胃癌、慢性萎缩性胃炎相关.cagA+ 菌株能引起更严重的炎性反应及上皮细胞损伤，炎性产物如氧自由基、h3 O2 、多胺和HOCL等与胃粘膜上皮癌变机制有关.细胞增殖加速是恶性肿瘤细胞的生物学特征之一，Hp能诱导胃粘膜上皮细胞增殖和凋亡［10］ ，cagA+ 菌株较cagA- 菌株有较强的促上皮细胞增殖作用和更低的促凋亡作用［11］ ，使胃液内Vit.C浓度更显著降低，胃粘膜端粒酶表达活性增加［12，13］ ，从而增加向肿瘤转变的危险性.Hp生存的局部环境发生变化，不利于细菌生长，导致Hp死亡，但其核酸片段、某些基因可能保留下来，继续对宿主细胞产生影响.原位PCR方法检测的是Hp的一段核酸片段cagA基因，同时保留了细胞的形态结构和组织的立体构型，可对cagA基因的分布进行定位研究.我们发现胃癌及癌旁组织中5例cagA基因呈胞核阳性，其核阳性是否为HpcagA基因整合宿主细胞染色体上，值得进一步探讨.cagA+ Hp菌株感染率在慢性萎缩性胃炎、胃及十二指肠溃疡、胃癌患者中无显著差异，cagA+ Hp菌株在慢性胃炎→萎缩→肠化→异形增生→胃癌这一癌变模式中可能起着先导作用，参与胃粘膜的早期损伤，并与其他因素如环境、宿主因素协同作用，诱发分子生物学改变［14，15］ ，最终导致胃癌的发生.
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