作者：王伯良，曹义战，晋兴，仲月霞，李金声，陆将，何保健，付国强
【关键词】 脑损伤
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of hyperbaric oxygen on diffuse injured rats brain histopathology. METHODS: We produced headinjured animal model by an weightdropt device designed by Marmarou， the effects of 02 MPa hyperbaric oxygen on brain injury were observed at different time after trauma（6 h， 1 d， 2 d， 3 d， 1 wk， 2 wk and 3 wk）. The expression of neurofilament（NF）was observed after trauma using immunohistochemistry methods. The content of water in the rat brain tissue was measured by dried/wet weight method. RESULTS: After trauma， diffuse neuronal degeneration and necrosis were seen and brain water content increased. Axonal rupture was observed by NF staining. But the number of damaged neurons and the brain water content decreased significantly in the HBO group (P&<005). CONCLUSION: These results show that diffuse degeneration， necrosis， edema and axonal injury occur after trauma and HBO treatment may decrease the damaged neurons and alleviate brain edema.
【Keywords】hyperbaric oxygenation; brain injuries; brain; pathology; rats
【摘 要】 目的： 研究高压氧（HBO）治疗对弥漫性脑损伤大鼠组织病理学的影响.方法：采用Marmarou介绍的落体打击装置制作弥漫性脑损伤大鼠模型，观察大鼠脑外伤后6 h，1 d，2 d，3 d，1 wk，2 wk，3 wk的病理学变化及0.2 MPa高压氧治疗对其影响，用免疫组化的方法观察损伤脑区NF表达情况，用干湿重法测量脑组织含水量.结果：大鼠脑外伤后顶叶皮层与海马出现不同程度神经元变性坏死；脑组织含水量较正常组高；视束处NF染色可见神经丝蛋白凝集成块，周围有空隙；给予高压氧治疗后坏死神经元较未治疗组明显减少，脑组织含水量明显降低（P&<0.05）.结论：大鼠脑外伤后出现广泛神经元变性坏死，大面积水肿，弥漫性轴突断裂，而高压氧治疗可明显减轻血管源性脑水肿，改善脑组织供氧，使变性坏死神经元数目减少.
【关键词】 高压氧; 脑损伤; 脑; 病理学；大鼠
0 引言
颅脑损伤，特别是重型颅脑损伤患者往往遗留不同程度的神经精神症状和智力障碍，给家庭及社会带来巨大的负担，甚至造成危害.经临床验证，高压氧（hyperbaric oxygen， HBO）治疗对颅脑损伤、脑缺血、脑卒中的恢复有较好疗效.由于临床研究的复杂性及难控制性，我们以大鼠为对象探讨高压氧对弥漫性脑损伤的治疗作用.
1 材料和方法
1.1 动物分组 选用第四军医大学实验动物中心提供的健康成年雄性 SpragueDawley大鼠75只，体质量350～380 g.随机分为正常对照组（5只）、损伤组（35只，损伤后6 h， 1 d， 2 d， 3 d， 1 wk， 2 wk， 3 wk， 每个时间点5只）与高压氧治疗组（35只，每个时间点5只）.所有动物实验均严格按照有关实验室动物照料及使用规则进行.
1.2 动物模型制备 采用Marmarou等［1］介绍的动物损伤方法制作弥漫性脑损伤（diffuse brain injury，DBI）模型.用质量为450 g的物体，从150 cm高度自由落下打击大鼠头部致伤.打击前用速眠新合剂腹腔麻醉，将大鼠置于厚海绵床上，用牙胶将一块直径10 mm、厚3 mm的钢板固定在大鼠的颅骨穹隆部，使大鼠头部在打击后沿外力作用向前运动并避免颅脑局限性损伤.
1.3 高压氧治疗 大鼠致伤3 h后，使用DWC4501150型动物实验舱进行高压氧治疗.动物进舱前，舱底置新鲜钠石灰，进舱后，先以纯氧连续洗舱8 min，使氧浓度达900 mL・L-1以上，再以0.013 MPa・min-1的加压速率，用15 min加压至0.2 MPa，在高压下停留60 min，其间用纯氧通风10 min.停留毕，20 min减至常压，每次共113 min，每日1～2次（第1周内2次・d-1，之后1次・d-1），每周休息1 d.损伤组动物亦置于舱内，模拟除压力、氧浓度外的类同实验组的其他过程和环境条件.实验过程中，通过观察窗仔细观察动物在舱内的行为状态.舱内温度18～24℃.
1.4 各组动物处理 采用Marmarou［1］等介绍的动物损伤方法制作弥漫性脑损伤模型. 治疗组大鼠给予高压氧治疗，在动物致伤6 h，1 d，2 d，3 d，1 wk，2 wk，3 wk时，将大鼠用20 g・L-1戊巴比妥钠（60 mg・kg-1）腹腔麻醉，开胸暴露心脏，插管，由左心室经主动脉快速灌注生理盐水200 mL， 40 mL・L-1多聚甲醛-0.1 mol・L-1PBS液400 mL，断头取脑，再置于多聚甲醛中浸泡6 h，根据大鼠脑定位图谱选取冠状切面（Bregma 4.16 mm）皮层、海马、下丘脑平面，按常规制成厚约5 μm石蜡切片，并行HE染色.石蜡切片常规脱蜡至水后，对抗原进行修复（切片置于pH 6.0，001 mol・L-1柠檬酸柠檬酸盐缓冲液于水浴锅中95℃ 30 min行热修复），自然冷却，001 mol・L-1KPBS洗涤，分别加入一抗NF（13000）6 h、二抗IgG（1300）2 h、ABC（1500）2 h（一抗、二抗及ABC均购自武汉博士德公司，一抗用3 g・L-1Triton X100处理的小牛血清稀释，二抗、三抗用KPBS稀释），DAB棕色显色，蒸馏水终止反应，水洗，常规脱水透明，中性树脂封固，KPBS代替一抗作阴性对照.
1.5 脑组织含水量测定 大鼠断头后快速取金属垫下顶部皮层脑组织一块，先称湿重，放入110℃烘箱烘烤24 h后再测干重.按公式计算脑组织含水量：
脑组织含水量（%）=〔（湿重－干重）/湿重〕×100%
1.6 变性坏死神经元计数 神经元损伤主要表现为神经元肿胀或皱缩，核仁消失，核膜溶解，胞质强烈嗜伊红性和胞核固缩.核酸进一步溶解消失，苏木素着色力丧失，表现为“鬼细胞”（gost cell）［2］.在海马与齿状回互包平面将脑组织的顶叶皮层、海马2个区，分别观察5个高倍镜视野（×400）记数变性坏死神经元数目.计算求得平均各区变性坏死神经元数目，以number/field表示.
统计学处理：细胞记数采用SPSS100软件作方差分析.
2 结果
2.1 动物行为 受打击的动物，伤后即刻出现呼吸暂停数秒，16只动物出现持续数秒的轻度全身抽搐（损伤组7只，治疗组9只），有的伴有去皮层综合征（表现为双侧前肢屈曲，双侧后肢强直，颈项强直等）.经辅助呼吸后多数可恢复规则的自主呼吸.与正常对照动物相比，麻醉恢复要迟十几分钟至半小时.各组动物在致伤后2 h基本苏醒.治疗组在致伤后3 h开始高压氧治疗，治疗过程中未见有动物抽搐发作.
2.2 外伤后脑组织含水量变化 脑外伤后脑组织含水量于外伤后6 h，1 d，2 d，3 d较正常组大鼠高（P&<001），其中2 d，3 d为高峰，之后有所下降，1 wk时基本恢复至正常水平.高压氧治疗组与正常组相比脑含水量也明显升高，但与损伤组相比明显降低（P&<001，Tab 1）.
表1 大鼠脑损伤后不同时间脑组织含水量测定（略）
Tab 1 Results of water content in rats brain tissue at different time after injury（略）
2.3 病理改变 大体：基底池有轻度的蛛网膜下腔出血，脑实质点状出血，多位于低位脑干背侧，脑皮层表面基本正常，无明显大面积挫伤或局灶性挫裂伤.
光镜观察：HE染色标本上，正常大鼠皮层神经细胞呈圆形或椭圆形，核膜完整，核仁清晰可见，细胞核呈淡蓝色，周围神经纤维组织致密，着色均匀.致伤后6 h，受损神经元肿胀，体积增大，着色深，核膜不清，核仁深染偏位或消失.致伤后1 d，损伤神经元主要表现为神经元胞体皱缩，顶端树突常呈螺旋状.致伤后2 d，神经细胞周围出现空隙，胞质呈强烈嗜伊红，甚至发生核固缩，胞质与胞核凝结在一起，界限不清，出现粉色细胞（pink neurons）或暗细胞（dark neurons）.致伤后3 d，受损神经细胞以粉色细胞或暗细胞为主，同时在毛细血管周围有星形胶质细胞肿胀和红细胞渗出.致伤后1 wk，2 wk，3 wk，受损神经细胞仍以粉色细胞或暗细胞为主，但数量逐渐减少，胶质细胞数目在致伤后1 wk最多，以后逐渐减少.距打击部位越远，上述改变越轻（Fig 1～6）.
顶叶皮层与海马的变性坏死神经元进行记数（Fig 5，6），发现HBO治疗组除损伤后6 h及3 wk外，其余各时间点变性坏死细胞数量明显少于损伤组（P&<0.05）.
2.4 NF免疫组化染色 动物致伤后用Mr为87 000的NF免疫组化染色，于视束处可见神经丝蛋白凝集成块，周围有空隙（Fig 7）.HBO治疗组在第3日，视束处神经丝蛋白凝集成块现象明显减轻，在第7日神经丝排列基本规则，紊乱现象基本消失.
图1 正常大鼠皮层神经细胞形态，细胞呈圆形或椭圆形，核膜完整，核仁清晰可见，细胞核呈淡蓝色，周围神经纤维组织致密，着色均匀（略）
Fig 1 Cortical neurons in normal rat brain. Showing round or ellipse neurons with integrated nuclear membrane， clarity nucleolus and light blue nucleus. The peripheral neuropil tissues was density and uniform HE ×400（略）
图2 损伤3 d皮层变性坏死神经细胞，神经元细胞形态不规则，核固缩，外侧有空隙，周围胶质细胞肿胀（略）
Fig 2 Degeneration and necrosis neurons in rat brain 3 days after trauma. Showing irregular neuron morphology with pyknosis， perinucleus loophole and occasional swollen perineuronal astrocytic HE ×400（略）
图3 正常大鼠海马神经元（略）
Fig 3 Hippocampus neurons in normal rat brain HE ×400（略）
图4 损伤3 d大鼠海马神经元（略）
Fig 4 Hippocampus neurons in rat brain 3 days after trauma HE ×400（略）
□：Damage group；■：Therapy group.
(n/f). n=5. aP&<0.05， bP&<0.01 vs damage group.
图5 各时间点顶叶皮层变性坏死神经元记数（略）
Fig 5 Number of degeneration and necrosis neurons in rat parietal cortex different times after trauma （略）
□：Damage group；■：Therapy group.
(n/f). n=5. aP&<0.05， bP&<0.01 vs damage group.
图6 各时间点海马变性坏死神经元记数（略）
图7 损伤3 d大鼠视束NF免疫组织化学染色（略）
Fig 7 NF immunohistochemistry staining in rat optic tract 3 days after trauma ABC ×400（略）
3 讨论
颅脑外伤发生率、致死率、致残率高，是严重危害人民群众健康的一种疾病.颅脑损伤严重程度主要与作用的部位、暴力大小、速度和挤压程度有关.一些临床和病理学者倾向于将脑损伤分为局灶性和弥漫性两种［3］，前者包括脑挫裂伤、颅内血肿和由于脑移位、扭转或颅内压增高造成的脑损害，后者包括弥漫性轴突损伤（DAI）、弥漫性脑肿胀和缺氧性脑损害等，而DAI对颅脑损伤患者的病情发展特别是伤后功能恢复有很大影响.Gennarelli等［4］用猴角加速度损伤模型较好的模拟了人的轴突损伤的表现，但模型制作复杂，费用昂贵.自从Fansano等（1964）首次报道高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）治疗颅脑外伤有效后，人们开始把高压氧疗法用于脑挫裂伤、脑干损伤及外伤后遗症等中枢神经系统疾病的临床治疗，收到较好疗效.近年国内有关高压氧治疗颅脑外伤疗效的报道数量越来越多.王汉勋等［5］证实高压氧治疗可明显减小外伤脑组织软化灶体积，减轻脑水肿，认为可能与其抑制内皮素生成有关.胡秉诚等［6］通过行走实验和平衡实验还发现高压氧治疗后，大鼠行走障碍明显减轻，前庭平衡功能较对照组好.但上述工作都是在局灶性脑损伤动物模型基础上进行的，并不能完全模拟临床脑外伤患者的病理表现，特别是DAI的病理表现.本实验采用的Marmarou模型是公认的一种较好的弥漫性脑损伤大鼠模型，可以较好的模拟DAI的病理表现，简便实用.
本实验成功复制了Marmarou介绍的脑损伤模型，损伤大鼠出现弥漫性神经元变性坏死、水肿，以外伤后第2，3日为重，此时变性坏死神经元数目最多，脑组织含水量较高，通过NF免疫组化染色我们还可看到视束处有神经丝蛋白溢出，凝集成团，这说明脑组织出现轴突断裂，轴突内容物溢出，与文献报道的弥漫性轴突损伤的病理表现一致［7］.
本实验对弥漫性脑损伤大鼠进行HBO治疗，结果表明治疗组大鼠较对照组脑损伤明显减轻，不仅变性坏死神经元数量显著减少，而且治疗组大鼠脑组织含水量也显著低于未治组，这说明通过HBO治疗，大量变性神经元被挽救，脑水肿被明显抑制，这些与文献报道一致［8-10］.
总之，大鼠外伤后出现广泛神经元变性坏死，大面积水肿，弥漫性轴突断裂，而高压氧治疗可明显减轻血管源性脑水肿，改善脑组织供氧，使变性坏死神经元数目减少.
HBO治疗脑损伤的作用机制在于能提高脑组织的氧含量和氧的有效弥散距离，改善脑的代谢，并且能降低颅内压，因此在脑外伤临床救治中有其独特的作用.此外，HBO对脑外伤后的神经功能保护可能与下列因素有关：① HBO抑制脑组织损伤后内源性毒性产物的生成，如氧自由基、一氧化氮［11， 12］，避免或减轻了自由基对神经细胞膜及其他生物膜的损害；② HBO减轻缺血细胞膜上的离子泵损伤［13］，使细胞内外的离子分布趋于正常状态，保持细胞膜的稳定.
参考文献
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