作者：冯蕾 舒青 秦鸿雁 刘军 李军林
【关键词】 遗传多态
关键词: HUMARA基因;遗传多态;衰老
摘 要:目的 探讨陕西人群HUMARA基因多态性分布及与衰老的相关性. 方法 应用聚合酶链反应（PCR-STR）技术先后对老年人（92例）和青年人（63例）的HUMARA基因的多态位点进行检测. 结果 在老年组中，片段大小在280～445bp之间，重复片段为（GCA），重复次数最少22次最多77次.频率分布在0.005～0.39，高峰在300～310bp（39%），杂合率为0.83，多态信息量（PIC）为0.76;在青年组中，片段大小在280～408bp之间，重复次数最少22次最多65次，频率分布在0.01～0.33，高峰在310～320bp（33%），杂合率为0.90，多态信息量（PIC）为0.83.老年组基因频率分布与青年组比较，有显著性差异（P&<0.01）. 结论 推测该位点遗传多态与细胞的衰老有一定的相关性，值得进一步研究.
Keywords:HUMARA gene;polymorphism;aging
Abstract:AIM To investigate the polymorphism of the HU-MARA gene in Shaanxi population of China and its relation-ship to aging.METHODS Polymorphism sites of the HU-MARA gene in92cases of unrelated aged people and63cases of unrelated youth in Shaanxi were detected by PCR-STR method.RESULTS The allele fragments ranged from280to445bp in the aged.The repetitive fragment was（GCA）and repetitive fraguency was22to77.The distribution of al-lele frequency was0.005to0.39.The heterozygosity rate was0.83and polymorphism information content（PIC）was0.76.The allele fragments ranged from280to408bp in the youth.The repeat number was22to65.The distribution of allele frequency was0.01to0.33.The heterozygosity rate was0.90and PIC was0.83.The distribution of polymor-phism of the HUMARA gene varied significantly between the aged and the youth（P&<0.01）.CONCLUSION The rela-tionship between the HUMARA gene and aging needs further study.
0 引言
分子遗传标记（molecular genetic markers）一般指DNA水平的遗传标记，所有分子遗传标记都具有标记数量大，大多数呈中性突变和遗传稳定的特点.数目可变串联重复序列（variable number of tandem repeat，VNTR）是人类基因组中近年来常用的一种多态标记，其应用十分广泛［1］ .雄性激素受体基因（HUMARA）位于Xq11-12，在外显子1有微卫星位点（GCA）.微卫星DNA是指2～3个核苷酸的串联重复序列，这类重复序列具有高度的变异性，并且倾向于不稳定，其重复次数的改变，可导致这些基因的表达变异，往往会引起细胞的癌变-称之为动态变异.近年发现一些遗传病的致病原因是这种分子动态突变所致［2，3］ .我们对老年人群HUMARA基因多态性的分布及其与青年人群是否存在差异进行研究，以此探讨该位点遗传标记是否随衰老而发生改变.
1 对象和方法
1.1 对象 青年组:63例（无血缘关系），年龄20～28岁，西京医院血库提供血液标本;老年组:92例，年龄60～75岁，为1998-03/1999-06唐都医院心血管内科陕西汉族住院患者.经动脉造影和超声多普勒检查无狭窄和粥样硬化斑块，无肿瘤.
1.2 方法 取静脉血3～5mL，采用蛋白酶K消化法及常规酚/氯仿法提取基因组DNA.PCR反应总体积为30μL，含基因组DNA0.5μg，dNTP100μmol L-1 ，1×PCR缓冲液（10mmol L-1 Tris-HCl，50mmol L-1 KCl，pH9.0，1g L-1 Triton-100，1.5mmol L-1 MgCl2 ，0.1g L-1 gelatin），引物浓度各为100μmol L-1 .引物序列为5’-GTGCGCGAAGT-GATCCAGAA-3’及5’-TGTGGGACGCAACCT-CTCTC-3’（美联公司合成）.经97℃变性10min后，在94℃加入Taq DNA聚合酶2.5U（上海Promega公司），加30μL石蜡油覆盖，然后进入循环，HU-MARA扩增的反应条件为:94℃变性30s，45℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次，最后1次循环72℃延伸10min.（PCR仪为PE公司480型）.扩增产物以pGEM-3Zf（+）DNA/HaeⅢMarker（华美公司）为对照，80g L-1 普通聚丙烯酰胺凝胶电泳，160V电泳4h，溴化乙锭染色，凝胶分析系统分析并照相.扩增产物送上海博雅公司纯化，测序，确定其重复单位及重复次数.计算各组基因频率、基因型频率，并按Hardy-Weinbreg平衡原理确认样本的群体代表性，组之间基因频率比较用χ2 检验.基因杂合率及多态信息量（PIC）计算使用Cooper的方法.
2 结果
2.1 老年组检测结果 陕西地区92例非肿瘤、非动脉粥样硬化老年人基因组DNA经PCR扩增后，检测出多态片段12个，片段大小在280～445bp之间，重复片段大小为3bp（GCA，Fig1），重复最少为22次最多为77次.频率分布在0.005～0.39，有两个峰，分别在300～310bp（39%）及310～320bp（23%）.该位点杂合率为0.83，PIC信息量为0.76（Tab1）.
图1 测序结果 略
表1 陕西正常老年人群与青年HUMARA多态分析 略
2.2 青年组检测结果 63例正常青年组经PCR扩增后，检测出多态片段11个，片段大小在280～408bp之间，重复最少为22次最多为65次.青年组频率分布在0～0.33，高峰在310～320bp（33%），其中300～310bp仅为0.09，360～370bp为0.该位点杂合率为0.90，PIC信息量为0.83（Tab1）.将老年组频率分布与青年组比较，差异有显著性（P&<0.01，Fig2，3）.
图3 HUMARA基因PCR扩增 略
3 讨论
HUMARA位于Xq11-12，在外显子1存在微卫星位点（GCA）n.微卫星DNA是人类基因组内具有高度多态性的遗传标志.重复序列拷贝数有一定的范围，超出范围，基因将变得不稳定，就可表现出病症或在染色体上出现脆性位点，此DNA中的碱基重复序列拷贝数发生改变而导致的突变称动态突变.这种拷贝数的改变如发生在有丝分裂过程中，不稳定性则表现在同一个体不同组织或细胞系的DNA呈现长度不同的多条杂交带［4］ .
HUMARA基因为一种配体依赖性的调节蛋白，它由一条肽链组成，其分子从N端至C端分为N端区、DNA结合区及雄激素结合区3个结构域.HU-MARA与雄激素结合后，通过与核中特定DNA序列-雄激素反应成分，调节靶基因的表达，产生生物效应［5，6］ .HUMARA是介导雄激素作用的关键大分子.雄激素-受体复合物与DNA结合，雄激素才可发挥其生理作用［7］ .
我们对陕西地区人群HUMARA的多态性进行检测，共检测出12个等位基因片段，表明此基因呈高度多态.根据等位基因频率计算得出该基因的PIC在0.70以上，表明该位点可提供信息量较高.我们将正常老年人与正常青年人HUMARA多态性进行比较发现，该位点的多态是否稳定，老年与青年有显著性差异.该基因多态片段分布改变，表明此遗传标记分布发生改变.分布范围青年为280～410bp，老年 为280～445bp;分布的中心位点青年集中在310～320bp，老年集中在300～320bp.而且部分片段有显著性差异，如:330～340，340～350，350～360和370～380bp.青年基因频率分别为0.11，0.10，0.05和0.05;而老年仅为0.04，0.03，0.005和0.01.而在360～370bp青年为0，老年为0.02.有人对青年人群与老年人群的Rb基因多态性进行分析得到类似结果［8］ .结果提示:这是老年人群遗传不稳定的表现之一，也可能是老年人衰老及易患疾病的机制之一.
参考文献:
［1］Qing HY，Shu Q，Liu SY，Ma QF.Relationship between Rb1.20VNTR polymorphism and esophageal cancer susceptibility in Shaanxi population ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（2）:135-137.
［2］Fomasarig M，Viel A，Valentini M.Microsatellite instability and MLH1and MLh3gemline defects are related to clinico-pathological features in sporadic colorectal cancer ［J］.Oncol Rep，2000;7:39-43.
［3］Gryfe R，Kim H，Hsieh ET.Tumor microsatellite instability and clinical outcome in young patients with colorectal cancer ［J］.N Engl J Med，2000;342:69-77.
［4］Zheng QS，Shu Q，Liu J，Zhang N，Zhang NZ.A study of polymorphism of Rb（intron17，20）in the aged ［J］.Zhonghua Laonian Yixue Zazhi（Chin J Geriatr），2000;19（5）:351-353.
［5］Jenster G，van der Korput HAGM，van Vroonhoven C.Do-mains of the human androgen receptor involved in steroid bind-ing，transcriptional activation and subcellular localization ［J］.Mol Endocrinol，1991;5:1396.
［6］Simental JA，Sar M，Lane MV.Transcriptional activation and nuclear targeting signal of the human androgen receptor ［J］.J Biol Chem，1991;266:510.
［7］Lu J，Wu JY，Zhang JS，Xu XC.Studies on the androgen in ex-ternal genital skin fibroblasts from patients with testicular femi-nization syndrome ［J］.Zhonghua Yixue Yichuanxue Zazhi（Chin J Med Genet），1995;12（5）:275-278.
［8］Shu Q，Zheng QS，Liu J.Polymorphism of Rb gene VNTR in the aged people ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（12）:1440-1442.转贴于