作者：刘秀红 申洪 史永亮 陈景元 陈耀明 季爱玲
【关键词】 人视网膜色素上皮细胞
关键词: 人视网膜色素上皮细胞;微波;基因
摘 要:目的 研究微波辐射与未辐射人视网膜色素上皮细胞（hTERT-RPE1）应激和凋亡相关基因转录的差异. 方法 应用基因芯片技术对2450MHz微波辐射、未辐射的视网膜色素上皮细胞的mRNA进行检测. 结果 在101条有关应激和凋亡的目的基因中发现有3条基因转录增加，有2条基因转录降低. 结论 微波辐射可引起细胞中与应激和凋亡有关的基因中多基因的改变.
Keywords:hTERT-RPE1;microwave;genes
Abstract:AIM To study the difference of gene transcription between hTERT-RPE1cells radiated by microwaves and hTERT-RPE1cells about stress and apoptosis related genes.METHODS cDNA microarray was used to detect the mR-NA from hTERT-RPE1cells and the cells radiated by mic-rowaves.RESULTS Among the101aim genes，there were5genes with differences，of which，3genes displayed increa-sing transcription，and2genes decreasing transcription.CONCLUSION Microwave could induce the gene transcrip-tion profile changes in hTERT-RPE1cells about stress and apoptosis response genes.
0 引言
基因芯片是将大量目的基因片断有序紧密地固定于基质上而制成，用2种不同的荧光染料将通过逆转录反应的2种组织或细胞的mRNA分别标记成2种探针，将探针混合后与基因芯片进行杂交、洗涤，用特有的2种荧光波长扫描芯片，得到这些基因在2种不同组织或细胞中的转录或表达谱图片，通过计算机软件处理分析出这些基因在不同组织中转录或表达的差异.基因芯片技术是探知在不同状态的同一细胞中、在肿瘤与正常组织中、不同组织和器官等中基因转录或表达差异的重要手段.自1995年Stanford大学的Schena和Brown等［1］ 发表第一篇基因表达谱芯片文章以来，目前已广泛地用于基因功能的研究.我们利用基因芯片技术对微波辐射致人视网膜色素上皮细胞中与应激和凋亡相关基因的转录变化进行了研究.
1 材料和方法
1.1 细胞培养及处理 人视网膜色素上皮细胞系hTERT-RPE1细胞于含100mL L-1 胎牛血清的DF12培养液中，37℃，50mL L-1 CO2 中培养.培养的hTERT-RPE1细胞在10mW cm-2 强度2450MHz的微波下辐射1h，同时连续纪录培养瓶中培养液的温度.分别收集10mW cm-2 微波辐射1h的和未辐射的hTERT-RPE1细胞.
1.2 RNA抽提与鉴定 采用Trizol一步法提取细胞总RNA.样品经分光光度计检测吸光度值，并进行热稳定实验，与-20℃和70℃保温1h后电泳检测28s，18s条带的变化.
1.3 mRNA纯化 以Qiagen公司Oligotex mRNA Midi Kit纯化得mRNA.按说明书操作与电泳检测.
1.4 核酸标记 参照Schena等［1］ 方法逆转录标记cDNA.Cy5-dUTP标记正常培养的hTERT-RPE1细胞提取的RNA，Cy3-dUTP标记10mW cm-2 微波辐射1h的hTERT-RPE1细胞提取的RNA，乙醇沉淀后溶解在20μL杂交液中.
1.5 芯片制备 芯片（型号为AR200S，由上海博星基因芯片有限责任公司提供）包含200个基因的cDNA克隆，包括与应激有关的基因、与凋亡有关的基因、看家基因（阳性对照）及阴性对照等.以通用引物进行PCR扩增，以Cartesian公司的Cartesian点样仪在TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样;玻片经水合、干燥、UV交联，再分别用2g L-1 SDS，水及2g L-1 硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用.
1.6 杂交与洗涤 将基因芯片和标记的cDNA分别在95℃水浴变性5min，将混合的标记cDNA加在基因芯片上，用盖玻片封片，置于60℃杂交15～17h.揭开盖玻片，依次以2×SSC+2g L-1 SDS，1g L-1 ×SSC+2g L-1 SDS，1g L-1 SSC洗涤10min，室温晾干.
1.7 检测与分析 用General Scanning公司的Sca-nArray3000扫描芯片，用ImaGene3.0软件分析Cy3和Cy5荧光信号强度，计算Cy5/Cy3值.判定基因差异转录的标准:①Cy3和Cy5信号值两者皆必须大于200，或Cy3和Cy5信号值其中之一必须大于800;②Cy5/Cy3大于2或小于0.5.
2 结果
2.1 总RNA 各组细胞总RNA吸光度A260 /A280 均大于2，热稳定实验70℃1h与-20℃1h电泳条带比较，显示28s，18s条带无明显降解（Fig1）.
2.2 微波辐射所致的温度变化 培养的hTERT-RPE1细胞在10mW cm-2 强度2450MHz微波下辐射1h，连续纪录培养瓶中培养液的温度（记算每10min的平均温度），细胞培养液温度变化见Fig2.
2.3 芯片杂交差异结果 标记基因Cy3和Cy5信号值两者皆必须大于200，或Cy3和Cy5信号值其中之一必须大于800的基因称为有效基因，101个目的基因中有88个为有效基因.按阳性标准，从88个有效目的基因中筛选出差异转录基因共5条，约占5%.其中10mW cm-2 微波辐射较未辐射细胞有3条基因转录增加，2条基因转录降低.差异转录基因见Tab1.
2.4 转录差异的基因 本实验基因转录检测表明，微波辐射较未辐射细胞在与应激相关的基因中有3条转录增加，分别为M31166，L24123，AF039704基因;
而与细胞代谢应激有关基因U49869（编码Ubiquitin 蛋白，一种重要的非溶酶体蛋白水解酶）和与细胞增殖有关的基因AF098799（编码核转运子RanBP7）转录降低.在本试验条件下未检测到与细胞凋亡和与细胞热应激主要相关的基因转录有显著的差异.M31166编码的TSG-14是一种TNF/IL-1可诱导的pentraxin家族成员［2］ ，为Mr 42×103 分泌型糖蛋白，与急性期蛋白如C反应蛋白、血清淀粉样蛋白在C末端有50%的同源性.细胞TSG-14表达增加可为处于应激状态的细胞提供能量，表现为葡萄糖摄入增加，脂肪蛋白质分解增加，细胞蛋白质合成减少.
图1 微波辐射与未辐射细胞70℃1h与-20℃1h后总RNA电泳图 略
图2 微波辐射与未辐射细胞培养液温度变化 略
表1 微波辐射较未辐射细胞转录差异的基因 略
基因L24123编码一种核蛋白Nrf1［3］ ，Nrf和c-jun杂合体结合到γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽S转移酶、NAD（P）-醌，氧化还原酶等基因启动子的抗氧化反应元件上（ARE），调节它们的表达.这些酶参与细胞应激与解毒，核蛋白Nrf和c-jun表达增加可显著上调这些酶的转录，从而增加细胞的抗应激能力.由基因AF039704编码的蛋白质是一种对pepstatin不敏感的酸性蛋白酶（CLN2）［4］ ，位于各种细胞的溶酶体中.当细胞处于应激状态时产生大量的自由基，可引起蛋白质变性、交联、酶失活等;这些变性失活的蛋白质被运送到溶酶体中由酸性蛋白酶（包括CLN2）分解.CLN2蛋白质缺乏或活性不足可导致一种渐进性、致命性的神经退行性疾病（neuronal ceroid lipofuscinosis，LI NCL）的发生［5］ .
微波辐射较未辐射细胞转录降低的基因有U49869，该基因编码Ubiquitin蛋白，Ubiquitin蛋白在细胞代谢应激后转录表达［6］ ，是细胞内非溶酶体蛋白水解酶系统中最重要的酶之一，细胞代谢水平与Ubiquitin表达强度有关.另一个转录降低的基因AF098799编码importin7（RanBP7）蛋白，importin7蛋白是公认的与组蛋白和核糖体蛋白质核内转运有关的关键性核转运受体，与细胞周期的递进和细胞增殖有关［7］ ，与细胞增殖有关的importin7蛋白表达降低，表现为细胞的生长暂时受抑.
基因芯片是近几年发展起来的一项前沿生物技术，它在一次实验中可以对上万种基因的转录或表达水平进行快速、准确、高效的检测.微波辐射可引起培养细胞的氧化应激反应，诱导细胞损伤或凋亡［8］ .细胞的氧化应激和凋亡反应涉及到细胞内多基因的参与，传统的研究方法仅仅从一个基因、一个蛋白入手研究其作用，所获得的信息往往比较单一，很难对 微波的作用机制有一个全面的了解.通过用基因芯片技术对微波辐射组细胞与正常组细胞在细胞应激和凋亡基因转录水平进行比较研究，可以发现与微波辐射应激反应有关的基因群，探讨微波辐射作用的分子机制，为进一步深入研究微波的生物学效应和预防提供线索.
微波辐射是一种由空间向生物体作用的交变电磁场，因生物体内含有导电程度不等的各种电解质、极性分子，以及非极性分子被极化成的偶极子等，它们随交变电场方向的变动而旋转，可与周围粒子发生碰撞、摩擦;这种取向运动使偶极子和体内带电胶体颗粒、电解质离子与周围介质产生快速振荡摩擦而产热.当生物受到一定强度的微波辐照并吸收部分波能后，可引起一系列因热效应造成的改变，如酶的灭活、蛋白质变性、生物膜通透性改变等变化，进而导致细胞损伤.我们利用基因芯片技术对培养的人视网膜色素上皮细胞、微波辐射的细胞中与细胞应激和凋亡有关基因的转录进行分析，比较微波辐射较未辐射细胞转录差异的基因信息，探寻微波辐射的生物学作用分子机制.
微波辐射存在着热效应.本实验条件下检测到培养的hTERT-RPE1细胞在10mW cm-2 强度2450MHz的微波下辐射1h，细胞培养液温度由27.10℃上升至31.80℃，上升约4.7℃，存在明显的热效应，但温度没有上升到热应激（即超过37.5℃）的程度.此结果可以解释与热应激反应蛋白Hsp70转录没有增加;而代谢应激蛋白Ubiquitin转录降低更能说明在本条件下微波辐射的热效应被照射过程中的低温状态所逆转.微波辐射较未辐射细胞相比有3条与应激相关的基因M31166，L24123，AF039704转录增加基因.综上所述，说明仅用微波辐射的热效应来解释微波辐射的所有生物学作用是不够的;微波辐射除了具有的热效应之外还具有微波辐射本身的生物学作用.此作用启动了急性期反应蛋白TSG-14转录给处于应激状态的细胞供给能量;核蛋白Nrf和c-jun转录增加将诱导细胞应激与解毒的超基因家族:γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽S转移酶、NAD（P）-醌，氧化还原酶等一组酶的表达;同时溶酶体酸性蛋白酶（CLN2）转录表达增加，可清除细胞内变性的蛋白质，使处于应激状态的细胞尽快清除有毒产物，维持细胞的正常功能.与细胞增殖有关的importin7蛋白表达降低也是细胞受激后的一种保护性反应.
在本试验条件下未检测到与细胞凋亡主要相关的基因转录有显著的差异，此结果表明在本试验条件下的微波辐射不足以诱导细胞凋亡.
参考文献
［1］Schena M，Shalon D，Davis RM，Brown PD.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray ［J］.Science，1995;270（5235）:467-470.
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