作者：吴红， 梁恒， 吴道澄，袁忠海
【关键词】 大孔吸附树脂
【Abstract】 AIM： To optimize the extraction and refinement of total saponins from Cornus officinalis by column chromatography of macroreticular resin. METHODS：Total saponins were extracted with 700 mL・L-1 of ethanol and purified with HPD 300 macroreticular resin and eluted with distilled water， 300 mL・L-1， 500 mL・L-1 and 700 mL・L-1 of ethanol. Adsorption capability and elution parameters were observed and compared with those extracted by routine solvents. RESULTS： Total saponins from Cornus officinalis enriched in 500 mL・L-1 of ethanol eluting solution. The dosage of elution reagents was 8 times as the sample volume and the elutive ratio was 818%. The average gaining rates of the two methods were 249% and 219% respectively. CONCLUSION： It is a good method to use macroreticular resin to adsorb and purify total saponins in cornus officinalis.
【Keywords】 cornus officinalis； saponins； macroreticular resin
【摘 要】 目的： 研究并优化大孔树脂法分离纯化山茱萸总皂苷.方法： 700 mL・L-１乙醇提取后，上HPD300型大孔吸附树脂，水洗后分别用300 mL・L-1，500 mL・L-1，700 mL・L-1乙醇洗脱，考察大孔树脂富集、纯化山茱萸总皂苷的吸附性能和洗脱参数，并与常规溶剂提取法相对照.结果： 山茱萸总皂苷富集于500 mL・L-1乙醇洗脱液部分，洗脱剂用量为上柱样品液的8倍，洗脱率达818%.大孔树脂法与常规溶剂法提取山茱萸总皂苷的得率分别为249%，219%.结论： 采用大孔吸附树脂可较好地纯化山茱萸总皂苷.
【关键词】 山茱萸；皂苷类；大孔吸附树脂
0 引言
山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.是我国40种用量大的骨干药材之一，是中、日、朝三国使用频率最高的25种植物药之一［１］.近代药理学研究表明，山茱萸具有抑菌抗病毒，调节人体免疫功能，降血糖和抗衰老等作用，其醇水溶液提取物（总皂苷）有明显的免疫抑制活性［２，３］，并对肾阳虚动物模型生命质量及多个脏器具有保护作用［４］.大孔吸附树脂(Macro Absorption Resin) 为一种选择性有机高聚吸附剂，具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用寿命长等优点.大孔吸附树脂现已被广泛应用于天然产物的分离和富集［５，６］，如苷与糖类的分离，生物碱的精制等，但在山茱萸总皂苷提取分离方面尚未见报道.本实验旨在探讨HPD300 型大孔树脂富集、纯化山茱萸药材中总皂苷的工艺条件与工艺参数，并与常规溶剂提取法相对照，从而确立富集、纯化山茱萸总皂苷的可行方法.
1 材料和方法
1.1 材料 F120型高速药物粉碎机(80~200目)；Unico 2100型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司 )；DZF型真空干燥箱；Sartorius BP221S电子天平；SB5200D超声清洗器.山茱萸药材样品由汉江制药厂提供并鉴定；HPD300型大孔吸附树脂 (河北沧州宝恩化工有限公司) ；人参皂苷Re标准品 (中国药品生物制品检验所)；香草醛、高氯酸、冰醋酸、甲醇、乙酐、苯胺、邻苯二甲酸均为分析纯；GF254薄层板；展开剂：正丁醇冰醋酸水(4∶1∶5)上清；氯仿甲醇水(65∶35∶10)；100 g・L-1硫酸乙醇显色.
1.2 方法
1.2.1 山茱萸总皂苷样品液的制备与山茱萸总皂苷的含量测定 精密称定60℃干燥至恒重的山茱萸粉末（80目），700 mL・L-1乙醇回流提取3次［７］，过滤，减压浓缩至无乙醇味，加蒸馏水适量，冰箱内静置过夜，离心得山茱萸样品液(含生药１ kg・L-1).吸取山茱萸样品液一定量，水浴下挥干，精密加入50 g・L-1香草醛冰醋酸02 mL，08 mL高氯酸，振摇混匀后于 65℃水浴加热20 min，冰水冷却后，加冰醋酸5 mL摇匀，随行试剂做空白，554 nm处测定A值［8］ .
1.2.2 大孔吸附树脂预处理与再生 大孔吸附树脂一般含有未聚合的单体及残留溶剂，使用前须先行除去.树脂用乙醇浸泡2 d，倾去上浮物后湿法装柱，用乙醇洗至流出液与水混合不呈现白色乳浊现象即可，然后以大量蒸馏水洗净柱中乙醇，水浸泡备用；再生时用900 mL・L-1乙醇洗脱至流出液无色，以大量水洗去醇即可.如果树脂颜色较深，可用一定浓度的酸或碱除去吸附性杂质，最后水洗至流出液呈中性.
1.2.3 洗脱剂浓度的选择 精密吸取山茱萸总苷提取液5 mL上柱，依次用100 mL蒸馏水，300 mL・L-1乙醇、500 mL・L-1乙醇、700 mL・L-1乙醇各60 mL洗脱，水洗脱液每25 mL收集1份，乙醇洗脱液每15 mL收集1份，比色法测定总皂苷含量，以容量瓶编号和总皂苷含量为坐标绘制洗脱曲线.另吸取人参皂苷Re、蔗糖和谷甾醇的混合溶液2 mL，加入大孔树脂柱，依次用水、500 mL・L-1，700 mL・L-1，900 mL・L-1乙醇洗脱，每2 mL分段收集，薄层层析检测收集液性质：洗脱液浓缩后点样，正丁醇冰醋酸水(4∶1∶5)上层径向展开，喷苯胺邻苯二甲酸，110℃烘5 min，检测糖的特征性斑点；氯仿甲醇水(65∶35∶10)下层展开，喷100 g・L-1硫酸乙醇，105℃检测皂苷的紫色斑点；另喷200 g・L-1三氯化锑氯仿溶液，60~70℃显色，检测谷甾醇（脂溶性杂质）.
1.2.4 大孔树脂吸附容量的测定 精密吸取2，4，6，8，10 mL的山茱萸总皂苷样品液，分次通过预先处理好的(30±02) g大孔吸附树脂柱，每次用20 mL水洗，流出液蒸干，Liebermann反应检测皂苷并测定总皂苷的含量，计算吸附容量.结果见Tab 1.
表1 HPD300型大孔树脂吸附容量测定结果（略）
Tab 1 Results of adsorption capability with HPD300 resin（略）
1.2.5 洗脱溶剂用量 吸取山茱萸样品液5 mL分别上柱，蒸馏水洗至流出液无色后，500 mL・L-1乙醇100 mL洗脱，分段收集，测定总皂苷含量.
1.2.6 两种提取工艺山茱萸总皂苷含量的比较 ① 大孔树脂法分离提取总皂苷：60℃下干燥至恒重的山茱萸500 g，6倍量、3倍量、2倍量700 mL・L-1乙醇提取3次，合并滤液，减压回收乙醇至一定量，加入适量水，继续回收至无醇味，加水使每2 mL药液相当于1 g原药.药液通过预处理的HPD300大孔吸附树脂柱，水洗至流出液无色后，改用500 mL・L-1乙醇洗脱，TLC检测洗脱终点.滤液通过铺有少量中性氧化铝的漏斗，减压回收乙醇，水浴上蒸至粘稠状，真空干燥即得山茱萸总皂苷，总皂苷浓度以人参皂苷Re计.② 溶剂法：另取干燥至恒重的山茱萸500 g，700 mL・L-1乙醇提取3次，合并滤液，减压浓缩后，加入适量水，乙醚、正丁醇分次萃取，正丁醇相减压浓缩，趁热倒入烧杯中，冷后加乙醚搅拌至沉淀完全，冰箱放置过夜，倾出上清液，沉淀用乙醚洗涤，50℃真空干燥，测定总皂苷含量.
2 结果
2.1 洗脱剂的最佳浓度 山茱萸提取样液总皂苷浓度以人参皂苷Re计［８］为24.53 mg・mL-1.
1~4： Water elution；5~8： 300 mL・L-1 of ethanol eluting liquid；9~12： 500 mL・L-1 of ethanol eluting liquid；13~16： 700 mL・L-1 of ethanol eluting liquid
图1 不同浓度乙醇洗脱曲线（略）
Fig 1 Ethanol elution curve of different concentration（略）
由Fig 1洗脱曲线可见山茱萸总皂苷主要集中在500 mL・L-1乙醇洗脱液中，占全部醇洗脱液中山茱萸总皂苷的81.8% .薄层层析结果显示：水能洗去大部分糖类杂质，而皂苷不易洗脱下来；500 mL・L-1乙醇洗脱液中含有人参皂苷Re，薄层未检出蔗糖及谷甾醇；因大部分皂苷已被500 mL・L-1乙醇洗脱，700 mL・L-1乙醇洗脱液未检出人参皂苷Re，但检出微量谷甾醇；900 mL・L-1乙醇洗脱液中检出谷甾醇，表明随着浓度增加，洗脱液中脂溶性杂质含量增大.由于水和900 mL・L-1乙醇洗脱部分基本不含皂苷，而500 mL・L-1乙醇洗脱部分则含81.8%的皂苷，说明其具有良好的解吸附能力.因此优选洗脱的条件为蒸馏水洗去糖类等水溶性杂质，500 mL・L-1乙醇洗脱总皂苷，900 mL・L-1乙醇洗脱再生.
2.2 大孔树脂吸附容量与洗脱溶剂用量 大孔吸附树脂的吸附容量大约为65 mg・g -1（Tab 1).前40 mL 500 mL・L-1乙醇洗脱率近90%，后60 mL洗脱率约4.3%，所以确定500 mL・L-1乙醇洗脱溶剂的用量为上柱样品液的8倍(Tab 2).
2.3 两种提取工艺制备山茱萸总皂苷的结果 大孔树脂法与常规溶剂法提取山茱萸总皂苷的得率分别为249%，219%(Tab 3).因此，采用大孔吸附树脂可较好地纯化山茱萸总皂苷.
表2 洗脱溶剂的用量测定（略）
Tab 2 Dosage of elution reagents（略）
表3 两种提取方法制得山茱萸总皂苷含量比较（略）
Tab 3 Total saponins content contrast of two extraction ways（略）
大孔树脂为一类新型非离子型高分子化合物，近年来已广泛应用于天然产物的分离与富集，尤其适用于水溶性化合物，如皂苷、黄酮及生物碱等的分离与富集.有文献报道，中药成分在树脂上的吸附可能为一放热过程，低温有利于提高中药成分的比上柱量［９］.因此，上样前将样品液放冰箱低温处理，树脂吸附量明显增大.提取液上柱前，必须进行抽滤或离心等预处理以除去沉淀和杂质，上样液愈澄清，山茱萸总皂苷的纯化率愈高，亦能提高树脂的使用寿命.此外，试验中发现溶液pH值对山茱萸总皂苷的纯化有一定的影响，梯度洗脱及增大树脂用量能否分离得到皂苷单体，还需进一步的实验研究.
300 mL・L-1乙醇能洗脱部分山茱萸总皂苷，但洗脱液中含酚类杂质较多；700 mL・L-1乙醇洗脱速度较500 mL・L-1乙醇快，洗脱能力相仿，但洗脱液中含部分脂溶性杂质（Fig 1).因此优选500 mL・L-1乙醇作洗脱剂.
由Tab 3可以看出，700 mL・L-1乙醇提取，样液上HPD300型大孔吸附树脂，8倍量500 mL・L-1乙醇洗脱所得总皂苷的收率略高于有机溶剂提取法，且大孔吸附树脂可以有效地除去糖类等水溶性杂质及脂溶性杂质，选择性地保留有效成分，所得山茱萸总皂苷，颜色明显比用传统溶剂法所得总皂苷浅，吸潮性也明显降低.常规的溶剂提取法成本较高，工艺复杂，特别是用有机溶剂进行梯度萃取在实际生产中较为困难.而新工艺采用水醇提取再上大孔树脂，不仅简化了工艺、而且使产品的收率和质量都明显提高，大孔树脂适宜于山茱萸总皂苷的分离、纯化.
山茱萸的化学成分主要含有环烯醚萜苷类、多糖、熊果酸、齐墩果酸、鞣质等［１０］.疗效保健成分主要是齐墩果烷系皂苷、马钱素及莫诺苷等苦味素物质［11］.目前国内尚无山茱萸皂苷类成分的法定对照品，故选用结构与山茱萸皂苷类成分接近的单体皂苷作对照，采用比色法计算总皂苷含量［８］.虽然测定结果有一定出入，但由于它们的显色原理一致，故在暂无法定标准品的情况下，仍不失为一种较佳的选择.
参考文献
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