关键词: 细胞型朊蛋白;受体;免疫组织化学
摘 要:目的 表达和纯化以朊蛋白（PrP）胞外部分与人IgG Fc段构建的融合蛋白PrPFc，并以此为配体蛋白，定位细胞型朊蛋白（PrPc）的受体在小鼠不同发育阶段脑内的分布. 方法 收集表达PrPFc的细胞培养液，通过蛋白A-琼脂糖柱亲和层析纯化，以PrPFc纯化蛋白与新鲜弱固定的组织切片反应，免疫组织化学法显示受体在脑内分布模式. 结果 在正常成年小鼠脑内，细胞型朊蛋白的受体分布以位于大脑皮层（包括新皮层和旧皮层）和纹状体为最多，其次为丘脑、下丘脑及脑干，再次为海马的CA区和齿状回及小脑的蒲肯野和颗粒细胞层，嗅球部位也有一些细胞呈阳性染色;出生后14d小鼠脑内朊蛋白受体与成年动物分布模式及染色强度皆类似，而出生当日及7d后受体分布与14d和成年动物相似，但染色强度明显较弱. 结论 朊蛋白受体（或结合蛋白）在脑组织有广泛分布;朊蛋白与其受体在脑组织中分布相似.
Keywords:cellular prion protein;receptor;immunohis-tochemistry
Abstract:AIM To recombinant protein PrPFc containing the extracellular portion of prion protein and human IgG Fc fragment was expressed and purified.This fusion protein was used as a ligand to localize the binding proteins for cellular prion protein in adult mouse brains.Distribution pattern of the binding proteins from different developmental stages of mice were detected and compared.METHODS PrPFc was secreted into the culture medium and purified through protein A-Sepharose column.The concentration and purity of the fu-sion protein were checked.Purified PrPFc was used to incu-bate with short fixed fresh frozen cryostat cut sections，and anti-Fc immunohistochemical method was applied to localize and reveal the binding patterns.RESULTS In6weeks mouse brains，cerebral cortex and striatum had the highest level of binding proteins.Thalamus，hypothalamus and brain stem had intermediate levels.CA area and dentate gyrus in hippocampus and Purkinje and granule cell layers in cerebel-lum were characteristically stained.Also in olfactory bulb there are some positive cells.PrPc binding proteins in P14mouse brains had both similar distribution patterns and stain-ing intensity with the adult group.Whereas positive staining in P0and P7mouse brains showed similar distribution areas with the above groups but with less intensity.CONCLUSION Binding proteins for prion protein are extensively distribut-ed in adult mouse brain.The distribution pattern of binding proteins for PrPc is similar with that of PrPc in brain.
0 引言
在细胞型朊蛋白（cellular prion protein，PrPc）在脑中含量丰富，分布广泛［1］ .而PrPc受体分子的鉴定也是研究的热点［2］ .但目前尚未有关于朊蛋白受体分布的报道.我们制备并纯化重组融合蛋白PrPFc作为配体与新鲜弱固定的组织切片上的受体蛋白结合，定位受体或结合蛋白在正常小鼠脑区的分布，并比较受体在小鼠不同发育阶段脑区分布的异同.
1 材料和方法
1.1 材料 表达PrPFc的CHO细胞（德国汉堡大学陈素珍博士提供），蛋白A-琼脂糖柱（Pharmacia），蛋白浓度测定BCA试剂（Pierce，USA），蛋白酶K（Sigma），冰冻切片机（Leica），兔抗Fc（Dianova），羊抗兔IgG（Vector），ABC混合试剂（Vector），C57BL/6J野生型小鼠（德国汉堡大学提供）.
1.2 方法 复苏稳定转染的表达分泌型PrPFc的CHO细胞，收集2～4L细胞培养液，经蛋白A-琼脂糖柱亲和层析富集纯化，蛋白经由柱子洗脱后浓缩和浓度测定，取蛋白样品两组，其中一组经蛋白酶K处理，另一组不做处理，经变性SDS-PAGE和Western blot分析.选用C57BL/6J野生型小鼠，年龄段为妊娠15d，出生0，7，14d，6wk，每组各取6只.妊娠15d，出生0，7d动物以断头法处死，出生14d和6wk动物以拉颈法处死，迅速取脑，置于已盛有组织保护液的容器内，然后连同容器放入液氮中迅速冷却，冰冻切片机冠状切片，厚度10μm，贴片于以明胶预包裹的载片.切片室温干燥2h，继以40g L-1 多聚甲醛室温固定20min，PBS洗后以PBS配的10g L-1 BSA室温封闭1h，将切片分组，以相同摩尔浓度的PrPFc和Fc片段孵育，4℃过夜.次日取出切片以PBS洗涤，然后以兔抗Fc（1 100，Dianova）室温孵育2h，PBS洗后再经生物素化的羊抗兔IgG（1 100，Vector）室温孵育2h，继以ABC混合试剂（1 100，Vector）室温2h，PBS充分洗片后，DAB染色.每步骤后的PBS洗片次数为3次，每次10min.
图1 － 图4 略
2 结果
纯化PrPFc的SDS-PAGE和以抗PrP和抗Fc为抗体的Western blot表明，所得蛋白为PrPFc，且纯度较高.蛋白酶K处理组相应的蛋白条带消失.为排除组织染色由PrPFc中的Fc段引起的假阳性反应，以Fc段作为对照，以相同摩尔浓度与相邻切片反应.由实验结果看，Fc在某些部位有弱染色反应，在分析阳性染色时予以减除.朊蛋白在脑内的受体分布很广泛，从大的脑区分布看，大脑皮层（Fig1A），（包括新皮层和旧皮层）以及纹状体分布最多，阳性细胞密度高，大脑皮层从内层向外层有逐渐增多趋势.其次丘脑、下丘脑以及脑干阳性染色分布也较均匀，仅阳性细胞密度较大脑皮层和纹状体略低. 海马和小脑的阳性细胞分布很有特点，海马的CA区和齿状回区染色密集（Fig2A），海马结构的其他区域则仅有稀疏阳性细胞分布.小脑则以蒲肯野细胞层和颗粒细胞层呈特征阳性染色，尤以蒲肯野细胞层阳性染色更强（Fig3A）.这些脑区的Fc对照染色仅有弱阳性染色（Fig1B，2B，3B）.嗅球部位也有中等数目的细胞染色，并且在高放大倍数下可见大部分染色位于胞膜和突起（Fig4A，4B，4C）.出生后14d的小鼠朊蛋白的受体分布和成年动物接近，无论在染色的分布区域和染色强度上都很相似.出生当日和生后7d小鼠脑的染色和14d组接近，但同时Fc组的染色也较14d组和成年组的Fc对照强.因此，综合来看，这两组的阳性染色强度较14d组和成年组弱，阳性染色的脑区分布无明显区别.妊娠15d组切片在反应过程中有局部脱落未纳入比较分析.
3 讨论
朊蛋白有两种形式，一种为正常的细胞型朊蛋白（PrPc），另一种为致病型朊蛋白（PrPsc），两种形式一级结构相同，仅构象稍有不同.但PrPc经蛋白酶K处理后发生降解，而PrPsc则抗蛋白酶处理.我们纯化的蛋白为PrPc，而结合实验所得到的结果就是PrPc的受体分布.大脑皮层和纹状体有最丰富的结 合蛋白成分，其次为丘脑、下丘脑和脑干区，而在海马和小脑呈特征分布，即分布集中于海马的CA区和齿状回区以及小脑的蒲肯野和颗粒细胞层.皮层、海马、纹状体和嗅球有最丰富的PrPc，其次为中脑和丘脑和小脑，再次为脑干［1］ .这个分布特点和受体的分布规律很相近，提示这些脑区有可能是朊蛋白和受体相互作用并发挥功能的部位.需重点提及的是受体在小脑的蒲肯野细胞层的特征性分布的意义，有报道在对一系朊蛋白基因敲除小鼠（Ngsk）的行为观察中，这些小鼠出生后成长正常，但在生后70wk时所有的小鼠都出现进行性共济失调症状.经解剖，这些动物的小脑由于广泛的蒲肯野细胞死亡而出现严重萎缩［3］ .受体分布丰富的脑区可用作受体分离材料并进行更进一步的鉴定和功能研究.
致 谢 德国汉堡大学Melitta Schachner教授的支持.
参考文献
［1］Liu T，Zwingman T，Li R，Pan T，Wong BS，Peterson RB，Gambetti P，Herrup K，Sy MS.Differential expression of cellu-lar prion protein in mouse brain as detected with multiple anti-PrP monoclonal antibodies ［J］.Brain Res，2001;896（1-2）:118-129.
［2］Schmitt-Ulms G，Legname G，Baldwin MA，Ball HL，Bradon N，Bosque PJ，Crossin KL，Edelman GM，DeArmond SJ，Co-hen FE，Prusiner SB.Binding of Neural Cell Adhesion Molecules（N-CAMs）to the Cellular Prion Protein ［J］.J Mol Biol，2001;314（5）:1209-1225.
［3］Sakaguchi S，Katamine S，Nishida N，Moriuchi R，Shigematsu K，Sugimoto T，Nakatani A，Kataoka Y，Houtani T，Shirabe S，Okada H，Hasegawa S，Miyamoto T，Noda T.Loss of cere-bellar Purkinje cells in aged mice homozygous for a disrupted PrP gene ［J］.Nature，1996;380（6574）:528-531.