作者：张杏泉 王少东 范清宇 殷剑宁 裘秀春 张殿中
【关键词】 组织型纤溶酶原激活物
关键词: 组织型纤溶酶原激活物;基因疗法;血管吻合口;血栓栓塞
摘 要:目的 探讨防止血管吻合口血栓栓塞的新方法，了解组织型纤溶酶原激活物基因疗法防止吻合口血栓栓塞的效果. 方法 ①将含有t-PA基因的重组质粒pAdCMVt-PA与缺陷型腺病毒大框架pJM17 共转染病毒包装细胞293细胞，获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒AdCMVt-PA.②实验动物随机分为对照组和治疗组，均用11-0尼龙缝线行大鼠颈总动脉原位端端吻合.治疗组吻合口注射AdCMVt-PA溶液，对照组注射AdCMV（不含t-PA的空载体）.提取吻合口组织的总RNA行RT-PCR，应用发色底物法检测吻合口组织的纤溶酶活力. 结果 治疗组RT-PCR在2.0kb前面有一条带，对照组则没有.治疗组术后第2，3，5，7和14日均可检测到纤溶酶活力，但第3日活力最高，对照组未检测到纤溶酶活力. 结论 克隆入腺病毒载体的t-PA基因可在吻合口组织中表达出有生物学活性的t-PA，可能有效地抑制吻合口血栓形成，提高吻合口通畅率.
Keywords:t-PA gene;gene therapy;vascular anastomosis;thrombo-embolism
Abstract:AIM To develop a new way to prevent vascular anastomotic sites from thrombo-embolism and to study the effect of gene therapy with tissue-type plasminogen activator（t-PA）gene on the formation of thrombo-embolism of vas-cular anastomotic sites.METHODS 1:Recombinant plas-mid pAdCMVt-PA was cotransfected into293cells with pJM17 ，and infectious but replication-deficient AdCMVt-PA was generated.2:Rats were randomly pided into control and treatment groups.11-0nylone medical suture was ap-plied to perform rat carotid artery end to end anastomoses.In the treatment group，AdCMVt-PA solution was injected into vascular anastomotic site while AdCMV（no containing t-PA DNA）solution was injected into the control group.RE┐SULTS When the isolated RNA was performed with RT-PCR，1.69kb band appeared in the treatment group，but band could not be found in the control group.The t-PA ac-tivity could be detected postoperation on the2nd，3rd，5th，7th and14th day in the treatment，but could not be detected in the control group.CONCLUSION t-PA gene can produce t-PA having biological activity at anastomotic sites，possibly preventing the formation of thrombo-embolism effectively and developing the anastomotic patency.
0 引言
近年来，随着血管吻合技术的提高及显微外科器械的完善，微小血管吻合的通畅率不断提高，但不能达到百分之百，吻合口局部血栓形成仍是通畅率低的主要原因［1］ .临床常用抗凝药物来防治，但效果不理想［2］ ，所以有必要寻找一种局部抗凝法来提高通畅率.我们采用吻合口注射含抗凝血基因的真核表达载体AdCMVt-PA溶液，以探讨局部基因疗法对吻合口血栓栓塞的预防作用.
1 材料和方法
1.1 试剂、质粒及实验对象 RT-PCR试剂盒购自华美公司;t-PA发色底物法检测试剂盒购自上海广慈医学高科技公司;质粒pAdCMVt-PA本实验室构建;pJM17 质粒和293细胞为本实验室保存;Wistar大鼠24只，体质量200～220g，随机分为对照组和治疗组各12只.293细胞用DMEM+100ml・L-1 小牛血清、青霉素100mg・L-1 和链霉素100mg・L-1 ，37℃，50ml・L-1 CO2 中培养.
1.2 重组腺病毒的繁殖、纯化和滴度测定［3，4］ 提取质粒pAdCMVt-PA及pJM17 DNA，将两者用磷酸钙沉淀法共转移至含有腺病毒E1区的293细胞中进行同源重组，得到腺病毒颗粒的粗提液.用此粗提液再感染293细胞，24h后收集细胞作PCR，确定阳性表达克隆.再在293细胞中扩增腺病毒，用氯化铯密度梯度离心法制备纯化的重组腺病毒，并进行透析处理.用噬斑分析法测定腺病毒滴度.分装小管，-80℃保存备用.
1.3 重组腺病毒在吻合口局部治疗实验 将大鼠以10g・L-1 戊巴比妥钠（40mg・kg-1 ）麻醉成功后，作颈部正中切口，解剖出双侧颈总动脉.用两个血管夹（上、下相距约1mL）阻断一侧颈总动脉后切断之，修剪外膜，以11-0尼龙线作原位端端吻合，每个吻合口缝10针.于吻合口注入AdCMVt-PA（治疗组）或AdCMV（对照组），10min后松血管夹.同法处理另一侧颈总动脉.
1.4 目的基因转录水平的测定 术后12h，治疗组和对照组各取2只大鼠，切取以吻合口为中心1cm长的血管.治疗组、对照组血管组织各放一起，采用一步法提取组织总RNA，再行RT-PCR.PCR引物:P1:5’-CG AAGCTT ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG3’HindⅢP2:5’-CG GGTACC TCA CGG TCG CAT GTT GTC ACG AAT3’BamHⅠ由上海Sangon生物工程有限公司合成.
1.5 目的基因表达产物的活性测定 分别于术后第2，3，5，7及14日随机取治疗组、对照组大鼠各2只，取出双侧吻合口，剥离结缔组织，纵行剖开.以同组术后同天数的吻合口组织为一份标本.每份标本行组织培养24h，收集上清，用发色底物法检测t-PA活性.
2 结果
2.1 确定阳性克隆 用磷酸钙沉淀法将pAd-CMVt-PA及pJM17 DNA共转移至293细胞中同源重组，将腺病毒颗粒粗提液再感染293细胞，24h后收集细胞作PCR，从而确定阳性表达克隆（Fig1）.
图1 略
2.2 腺病毒的制备 在293细胞进行同源重组得到具有感染能力且含有目的基因的腺病毒颗粒，经扩增、纯化，用噬斑法测定病毒滴度为5×109 pfu・mL-1 .
2.3 动物模型情况 两组大鼠全部存活，切口局部无感染、血肿及动脉瘤.切取吻合口标本时见全部血管吻合口均通畅、搏动好.
2.4 RT┐PCR产物电泳 治疗组吻合口组织提取总RNA并RT-PCR，电泳，在2.0kb前有一条带，与阳性对照pAdCMVt-PA的PCR产物t-PA（1.69kb）DNA长度一致;对照组无此带.说明t-PA基因可在吻合口组织中转录出相应的mRNA（Fig2）.
2.5 t┐PA活性测定 治疗组于术后第2，3，5，7及14日检测的t-PA活性分别为:320，480，441，412和398IU・g-1 组织，说明t-PA基因可在吻合口组织中表达出有生物学活性的基因产物，表达量第3日最高，持续2wk以上;对照组则未检测到纤溶酶活性.
3 讨论
基因治疗的关键在于将目的基因特异地导入靶组织或靶细胞内，并确保导入的基因在宿主细胞内能表达出有活性的蛋白质［5］ .随着分子生物学的发展，目前有两种方法可将外源基因导入血管壁:①先将外源基因导入培养的内皮细胞，然后回输体内使之贴附于血管壁［6］ ;②采用DNA重组技术，先构建真核表达载体，再通过导管直接注入一段血管内.前者需体外培养细胞，费时易污染;后者需用特制的球囊导管，且需阻断血流一定时间.Flugelman［7］ 曾构建了含报告基因的逆转录病毒载体，并经特制的球囊导管注入某段血管内，但转染的细胞数很低.究其原因，我们认为:逆转录病毒载体虽有能高效转移并整合入宿主染色体及拷贝数恒定等优点，但它只能感染分裂复制的细胞，而对高度分化、不分裂的细胞转染效率较低甚至不能实施基因转移.
血管内壁由血管内皮细胞构成，因其直接与血液相接触，故最先被用于冠心病基因治疗的靶细胞.但其属分化成熟细胞，所以逆转录病毒转染率低.而腺病毒不但能感染复制分裂细胞，而且也能感染处于G0 期的非分裂复制细胞［8］ .更重要的是经重组的腺病毒可直接用于在体细胞的转染，不必将靶细胞从体内取出，修饰后再回输体内等繁琐劳动.因此，腺病毒载体最实用于心血管系统的基因转移.唯一缺点是腺病毒感染细胞时，其DNA不整合到宿主细胞染色体中［9］ ，从而影响目的基因的长期表达，但对于显微小血管吻合后局部溶栓治疗，表达7～10d足以满足需要.
1981年Rijken和Collen首次将组织型纤溶酶原激活物（t-PA）从Bowes黑色素瘤细胞培养上清中分离出来，并临床应用证实了其优良的抗栓性能.1983年Pennica等人第一个克隆出t-PA cDNA全长，使得其基因治疗成为可能.本研究国内、外首次将含t-PA基因的腺病毒载体注入吻合口，并经RT-PCR及t-PA发色底物法检测，证实了t-PA基因导入吻合口血管壁中，并表达了有生物学活性的t-PA产物，第3日最高，可持续2wk以上.众所周知，t-
PA对纤维蛋白有高度的特异性，两者结合后构象改 变，以致极易与纤溶酶原形成三联复合物，使t-PA易激活纤溶酶，使纤维蛋白降解，达到溶栓目的［10］ .而血管吻合后，纤维蛋白易于吻合口局部沉积，t-PA是有选择地在纤维蛋白表面活化纤溶酶原的.治疗组血管吻合口组织表达了有活性的t-PA，这可能为防止血管吻合口血栓栓塞提供了一种简单实用的新方法，可望普及推广.
参考文献
［1］Wieslaander JB，Aberg M，Dougan P.Acumulation of isotype labelled platelets in small arteries after end to end and end in end anastomoses in the rabbit ［J］.Br J Plast Surg，1982;35（3）:158-159.
［2］Radie ZS，Malley MK，Mikat EM.The role of aspirin and dipyridamole on vascular DNA synthesis and intimal hyperplasia following deendothelialization ［J］.J Surg Res，1986;41（6）:84-85.
［3］Lu JG，Lin C，Wu JS.Inhibitory effect of recombinant aden-oviruses p16on the growth of cholangiocarcinoma cell ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（4）:464-468.
［4］Lu JG，Lin C，Huang ZQ，Ma QJ.Experimental therapy on nude mice model bearing subcutaneous tumor of cholangiocar-cinoma cell line by recombinant adenoviruses p16with cisplatin ［J］.Di-Si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（7）:838-840.
［5］Zhang XQ，Fan QY，Zhang HZ.Cloning of t-PA cDNA and construction of its eukaryotic expressing vector ［J］.Di-Si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（12）:S116-S119.
［6］Plautz G，Nabel EG，Nabel GJ.Introduction of vascular smooth muscle cells expressing recombinant genes in vivo ［J］.Circula-tion，1991;83（7）:578-579.
［7］Flugelman MY，Jaklitsch MT，Newman KD.Low level in vivo gene transfer into the arterial wall through a perforated balloon catheter ［J］.Circulation，1992;85（8）:1110-1112.
［8］Mill R，Curiel DT.Towards the use of replicative adenovirus vectors for cancer gene therapy ［J］.Gene Ther，1996;3（1）:557-558.
［9］Curiel DT.Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1991;88（9）:8850-8852.
［10］Collen，D.On the regulation and control of fibrinolysis ［J］.Thromb Haemostasis，1980;43（1）:77-89.