【摘要】 目的 观察哮喘豚鼠肺和骨髓组织嗜酸粒细胞趋化因子受体3（CCR3）及嗜酸粒细胞（EOS）不同时相表达的变化， 探讨哮喘发病的可能机制。方法 用卵白蛋白(OVA)和生理盐水致敏法制备豚鼠哮喘和对照模型， 分为正常对照组（N）及哮喘组（A、B、C、D、E），每组8只，于激发后30 min，6 h，12 h，24 h，48 h处死，瑞氏染色计数骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例，免疫组织化学技术检测骨髓中CCR3的表达；制备豚鼠肺组织病理标本， 苏木精-伊红染色，免疫组化检测肺组织中CCR3的表达。结果 ①哮喘组骨髓和外周CCR3及EOS表达明显增加；②OVA激发后，骨髓和外周CCR3及EOS表达：30 min变化不明显，6 h，12 h达到峰值，24 h开始下降，48 h恢复正常水平；③骨髓的变化早于外周，CCR3的表达早于EOS的增多，且CCR3和EOS呈线性相关。结论 哮喘豚鼠肺组织和骨髓之间存在骨髓EOS细胞到循环再到肺组织的通路，CCR3表达增强， 为EOS从骨髓快速募集到肺组织提供了可能。
【关键词】 支气管哮喘 CCR3 EOS 骨髓 豚鼠
Abstract:Objective To explore the pathogenetic mechanism of asthma by tracking the expressions of CCR3 and EOS in lung tissue and bone marrow in guinea-pig asthmatic models.Methods Guinea pigs (GP) were sensitized and challenged with OVA to establish the asthmatic model (groups A， B， C， D and E). The control GP (group N) were instead given injections of sterile saline. The sensitized GP were killed 30 min， 6 h， 12 h， 24 h and 48 h after the challenge， with the control GP killed 12 h after the second injection. Slides prepared from peripheral blood and bone marrow， were stained with Wright′s stain to count the total number and percentage of EOS. The expression of CCR3 in bone marrow and lung tissue was detected by immunohistochemistry.Results ① The total counts of EOS and the expression of CCR3 in bone marrow and lung tissue were significantly higher in allergic-asthma models than in controls. ②After the challenge with OVA， the levels of CCR3 and EOS remained in the normal range at 30 min， began to rise and reached the peak at 6 h and 12 h， found to be decreased at 24 h and returned to normal by 48 h. ③The bone marrow changes appeared earlier than that in the periphery. The expression of CCR3 was earlier than the recruitment of EOS and they two were of linear correlation.Conclusion There is a pathway for the bone marrow EOS stem cells to move to the circulating blood to the lung tissue. The increase of CCR3 expression would enable the recruitment of EOS from bone marrow to the lung.
Key Words: asthma; CCR3; EOS; bone marrow
哮喘是多种细胞（如嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症疾患，哮喘气道炎症的特征性改变为嗜酸粒细胞（EOS）的浸润和活化。气道黏膜下的 EOS主要来源于骨髓CD34+干细胞在某些信号(如eotaxin，IL-5)的驱动下分化成熟为EOS，释放入外周血，在多种趋化信号的引导下向肺内定向募集。这一现象意味着从骨髓-循环-气道，存在着调控EOS定向迁移的信号通路。在EOS趋化、募集于肺组织内的过程中，嗜酸粒细胞趋化因子受体3（CCR3）起着重要作用。本实验探讨哮喘发作时骨髓和气道之间的调控EOS定向迁移信号通路;为临床开发治疗哮喘新方法提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 雄性豚鼠48只， 体重(250±50) g，由徐州医学院动物中心提供。随机分为对照组（N）、哮喘组(根据处死时间分为A、B、C、D、E组)， 每组8只。鸡卵白蛋白(ovalbumin， OVA，美国Sigma公司)、CCR3多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒(武汉Boster公司) 、奥林巴斯图像采集系统、德国百瑞雾化器和自制雾化箱。
1.2 方 法
1.2.1 哮喘模型的建立 哮喘组于第1天腹腔注射抗原混悬液1ml (OVA 100 mg、氢氧化铝200 mg) ， 2周后将豚鼠放于自制雾化吸入箱内， 喷射雾化吸入10 g/L OVA 20 min，连续5天［1］。对照组于第1天腹腔注射1 ml生理盐水， 2周后喷射雾化吸入生理盐水20 min，连续5天。最后1次雾化吸入后，哮喘组A、B、C、D、E分别于30 min，6 h，12 h，24 h，48 h处死动物，对照组12 h处死，取材并作相应测定。
1.2.2 骨髓和外周血EOS计数 于末次激发后，断颈处死豚鼠， 取颈动脉血制作血涂片。取两侧股骨， 去掉两端骨骺， 剖开骨干髓腔，以含肝素100 U/ml的生理盐水溶液将骨髓细胞冲洗出， 4℃，1000 r/min离心5 min后，沉渣涂于多聚赖氨酸处理的玻片上，干燥后以40 g/L多聚甲醛固定30 min，-20℃保存备用。骨髓和外周血涂片用瑞氏染色， 随机计数200个白细胞， 并计算其中EOS百分比。
1.2.3 骨髓细胞CCR3表达的检测 采用SABC免疫组织化学法检测骨髓中CCR3的表达。以兔抗大鼠CCR3 IgG为一抗， 以生物素化的羊抗兔IgG为二抗。取骨髓沉渣涂片， 按SABC免疫组化试剂盒说明书处理。在光镜下观察结果，胞膜为棕黄色者为阳性细胞， 在光镜(×400) 下随机选取5个视野， 计数阳性细胞数占白细胞总数的比例， 结果以±s表示。
1.2.4 肺组织EOS计数及CCR3表达的检测 无菌操作下切取部分肺组织，40 g/L多聚甲醛固定， 常规石蜡包埋、切片， 分别进行H-E染色、CCR3免疫组化染色(严格按武汉Boster公司SABC试剂盒说明书操作)。肺组织切片H-E染色后， 每张切片计数200个细胞， 计算其中EOS百分比。免疫组化计数方法: 光镜下观察胞膜着棕黄色为阳性细胞。每例选择1张染色较好的切片， 显微镜下随机选取5个高倍视野(×400) ， 计数， 取每视野的均数， 结果以±s表示。
1.2.5 统计学处理 计量数据均采用±s表示，用 Stata7.0软件对数据进行t检验和相关分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 哮喘豚鼠气道病理学改变 肺组织H-E染色光镜下可见：与对照组相比，哮喘组大、中、小支气管收缩，黏膜水肿，平滑肌增厚，上皮细胞肿胀，部分上皮细胞变性、坏死脱落，杯状细胞增生，支气管管腔狭窄甚至闭塞，黏液栓形成；支气管周围血管扩张、充血，黏膜、黏膜下层及肺泡区有大量的炎症细胞浸润，主要为EOS、淋巴细胞、单核细胞；肺泡间隔增厚。激发后30 min上述改变不明显，6 h，12 h肺组织病变最明显，24 h，48 h逐渐恢复到正常肺组织表现。见图1。
2.2 外周血涂片、骨髓细胞涂片及肺组织EOS计数 结果见表1。可以发现哮喘（豚鼠）激发后30 min，与对照组相比变化不大，且外周血EOS百分比稍有下降，但无统计学意义；6 h，12 h升高明显(P&<0.01)；24 h开始下降(P&<0.05)；48h基本恢复到正常水平。值得注意的是哮喘组不同时间点之间EOS也存在着变化：6 h较30 min，EOS升高明显(P&<0.01)；12 h较6 h，肺组织EOS变化不大(P&>0.05)，骨髓和外周血升高(P&<0.05)；24 h较12 h，48 h较24 h，EOS呈下降趋势(P&<0.01).可以看出在6 h，12 h时EOS增多最明显，与气道病理学改变相一致，24 h开始下降，48 h回到正常水平。骨髓的变化先于肺和外周血，且持续的时间短。
2.3 肺组织和骨髓中CCR3蛋白的表达 结果见表2。 哮喘组肺组织和骨髓中CCR3 蛋白阳性细胞呈棕黄色，主要定位于细胞膜。肺组织中，气道黏膜、黏膜下层及血管周围、肺泡区有大量呈棕黄色的阳性细胞，气道黏膜上皮细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞也有CCR3蛋白表达，对照组在上述部位仅少量表达。骨髓细胞中，呈棕黄色CCR3 蛋白阳性细胞大量表达于各阶段Eos细胞表面，见图2。不同之间点的表达趋势和EOS的变化一致：与对照组相比骨髓及肺组织中CCR3 30 min时开始升高（P&<0.05）； 6 h、12 h达到高峰（P&<0.01）；24 h开始下降（P&<0.05）；48 h基本恢复到正常水平。哮喘组不同时间点之间CCR3表达也存在着变化：6 h较30 min升高明显（P&<0.01）；12 h较6 h，肺组织继续升高（P&<0.05），骨髓中持续高峰（P&>0.05）；24 h较12 h，48 h较24 h渐下降至正常水平（P&<0.01）。骨髓先升高，肺组织随着变化，但持续时间长于骨髓。 表1 对照组、哮喘组的EOS计数表2 肺组织和骨髓中CCR3 蛋白的表达
3 讨 论
CCR3主要由单一肽链组成的7个螺旋跨膜结构，属于G 蛋白藕联受体家族。CCR3 主要表达于EOS上，介导其迁移及脱颗粒反应。Shannon A 等［2］研究发现eotaxin及eotaxin-2 通过与CCR3的结合可以诱导部分CCR3内陷和EOS 的变形，有助于EOS 的活化和迁移。Joubert P 等［3］发现eotaxin 作用于气道平滑肌细胞CCR3可诱导平滑肌细胞迁移和增殖，使细胞内Ca2+增高。Adachi T 等［4］发现支气管上皮细胞表达CCR3 可激活和诱导有丝分裂原激活蛋白（MAP）活化和细胞因子的产生。可见CCR3无论在气道炎症还是重塑方面都起到了重要作用。本实验发现哮喘时不但肺组织EOS浸润明显，CCR3表达增加，而且黏膜上皮细胞、平滑肌细胞上CCR3也有明显表达，平滑肌增厚，和既往研究一致。
以往研究表明， 在过敏性哮喘患者的骨髓中， 成熟和非成熟的EOS CCR3表达水平显著升高［5］。Lamkhioued等［6］研究证实，CCR3 可表达于骨髓CD34+造血细胞表面，在体内外eotaxin 与CCR3 结合后均表现出明显的趋化活性，促使骨髓中CD34+细胞产生增多。并且单独或与IL-5协同作用可以使骨髓CD34+祖细胞定向分化为EOS，并向外释放、募集［7］。本实验发现哮喘组骨髓CCR3表达明显高于对照组，与EOS各级细胞呈线性相关，并且CCR3的表达高峰在6 h，早于EOS增加，释放的高峰时间12 h，说明在某些因子的作用下，骨髓祖细胞表达CCR3，进一步使EOS分化、释放增多，利于炎症的发展。
近年研究的重点倾向于骨髓、肺组织、循环之间的关系，以便更好地为治疗哮喘开阔思路。本实验发现无论肺组织还是骨髓在哮喘激发初始时变化不明显，但是外周血EOS呈下降趋势，考虑为向肺内募集量大于骨髓释放量；在6 h后，骨髓CCR3和EOS均明显增加，外周血EOS增多，肺内表达增多，12 h达到高峰，24 h开始下降，说明伴随骨髓干细胞CCR3表达增加，EOS增多、释放，外周的EOS也在变化。证明在骨髓到外周血再到肺组织存在着密切的细胞信号环路联系。如果能切断这方面的环路，如通过抑制CCR3的表达，或者给于其拮抗剂，将对哮喘的治疗有很重要的意义。
【参考文献】
［1］ 钟南山.支气管哮喘基础与临床［M］.北京：人民卫生出版社，2006：464.
［2］ Bryan SA， Jose PJ， Topping JR， et al. Responses of leukocytes to chemokines in whole blood and their antagonism by novel CC-chemokine receptor 3 antagonists［J］.Am J Respir Crit Care Med， 2002，165（12）:1602-1609.
［3］ Joubert P， Lajoie-Kadoch S， Labonte I， et al. CCR3 expression and function in asthmatic airway smooth muscle cells ［J］. J Immunol， 2005，175（14）:2702-2708.
［4］ Adachi T， Cui CH， Kanda A， et al. Activation of epidermal growth factor receptor via CCR3 in bronchial epithelial cells ［J］. Biochem Biophys Res Commun，2004，320（2）:292-296.
［5］ Zeibecoglou K， Ying S， Yamada T， et al. Increased mature and immature CCR3 messenger RNA + eosinophils in bone marrow from patients with atopic asthma compared with atopic and nonatopic control subjects［J］. J Allergy Clin Immunol， 1999， 103 (1 Pt 1) : 99 - 106.
［6］ Lamkhioued B， Abdelilah SG， Hamid Q， et al. The CCR3 receptor is involved in eosinophil differentiation and is up-regulated by Th3 cytokines in CD34+ progenitor cells［J］. J Immunol， 2003，170（1）:537-547.
［7］ Palframan RT， Collins PD， Williams TJ， et al. Eotaxin induces a rapid release of eosinophils and their progenitors from the bone marrow ［J］. Blood， 1998， 91(7): 2240-2248.