关于脐血淋巴细胞亚群水平及其临床意义

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　　　　　　作者：王军，何艳芳，陈群娥，张绍美，赵 光，高莉莉

【摘要】 目的 检测新生儿脐血淋巴细胞亚群水平，探讨新生儿脐血的免疫功能。方法 24例正常足月自然分娩新生儿脐血作为研究对象，26例健康成年献血员（男女不分）的血液作为对照，采用流式细胞术（FCM）检测脐血和成人血液中CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）、CD19（+）、CD16+56（+）、CD4（+）/CD8（+）的水平，对结果进行统计学分析。结果 脐血中CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）的量明显低于对照组（P＜0.01或＜0.05）；CD4（+）/CD8（+）的水平明显高于对照组（P＜0.01）；CD19（+）、CD16+56（+）的水平与对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。结论 脐血的淋巴细胞免疫功能低于健康成人。
【关键词】 脐血；免疫功能；淋巴细胞亚群；流式细胞术
　　Abstract: Objective To study the levels of lymphocyte subsets in cord blood and learn the immune function of cord blood. Methods Flow cytometry was used to show the levels of lymphocyte subsets (CD3（+）， CD4（+）， CD8（+）， CD19（+） and CD16+56（+）) and to calculate the ratio of CD4（+）/CD8（+） in the cord blood from normal full-term neonates (cord blood group) and in the peripheral blood taken from healthy adult blood donors (control group). The results were analyzed statistically. Results The levels of CD3（+）， CD4（+） and CD8（+） were significantly lower than that in control group（P＜0.01 or ＜0.05). The value of CD4（+）/ CD8（+） was significantly higher in the cord blood than that in the control（P＜0.01）. No significant differences in the levels of CD19（+） and CD16+56（+） were found between the cord blood and the control （P&>0.05）. Conclusion The lymphocyte immune function of neonates′ cord blood is lower than that of the peripheral blood from healthy adults.
　　Key words： cord blood； immune function; lymphocyte subsets; flow cytometry
　　脐血中具有高质量的未成熟造血干/祖细胞，比骨髓和外周血更有利于造血功能的重建，脐血在基础研究和临床应用中不受道德伦理的限制，脐血细胞的收集不会对新生儿造成伤害，脐血造血干/祖细胞可以低温保存，解冻后并不丢失增生能力。脐血中含有丰富的免疫活性物质和功能不成熟的免疫细胞，这些活性物质和免疫细胞在脐血造血干/祖细胞的成功移植及肿瘤免疫中发挥重要作用。本研究利用流式细胞术（FCM）检测脐血中CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）、CD19（+）、CD16+56（+）、CD4（+）/CD8（+）的水平，探讨脐血淋巴细胞免疫功能特点，为脐血在临床的应用提供实验依据。
　　1 资料和方法
　　1.1 研究对象 24例脐血是我院2004年9月—2006年4月采集的，均为足月自然分娩健康新生儿脐血，胎龄37～42周，平均（ 38.4±2.5）周；出生体重为2500～4000 g，平均（3293±386） g，Apgar评分均为8～10分。26例对照组血清来自社会健康成年献血员，无男女区分。
　　1.2 方法 取脐血和对照组血液各4 ml，当日测定。采用FCM测定脐血中CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）、CD19（+）、CD16+56（+）、CD4（+）/CD8（+） ，实验所需的单克隆抗体（单抗）FITC-CD3（+）、FITC-CD4（+）、FITC-CD8（+）、FITC-CD19（+）、FITC-CD16+56（+）、FITC-CD4（+）/CD8（+）购自美国Becton-Dickinson公司，流式细胞仪为美国Becton-Dickinson公司产品。
　　1.3 统计学处理 数据以±s，采用SPSS13.0软件包处理结果。所有数据进行t检验，P＜0.05为差异有显著性。
　　2 结 果
　　脐血清CD19（+）、CD16+56（+）水平与对照组比较差异无显著性（P＞0.05）；脐血中CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）水平显著低于对照组（P＜0.01或＜0.05），CD4（+）/CD8（+）水平显著高于对照组（P＜0.01）。见表1。表1 脐血和成人血液中淋巴细胞亚群测定结果比较
　　3 讨 论
　　T淋巴细胞在宿主抗移植物免疫反应中发挥重要作用，因此，从亚群变化来观察T淋巴细胞显得尤为必要。外周成熟的T细胞无论在表型还是在功能上都是异质性群体，根据其表面标志细胞黏附分子（CD）的不同，淋巴细胞可分为CD4（+）和CD8（+）细胞两大亚群。CD3（+）为全细胞标准，代表着T淋巴细胞总数，一般为CD4（+）和CD8（+）细胞之和，CD4（+）/ CD8（+）比值恒定维持细胞免疫反应的平衡。通常用检测T淋巴细胞亚群的方法来间接反映细胞免疫功能的状况。CD4（+）能识别抗原，分泌多种淋巴因子，能辅助B细胞、T细胞活化，从多方面调节和增强免疫力。CD8（+）细胞常在免疫应答后期增多，能识别可溶性抗原， 分泌抑制因子，减弱或抑制免疫应答。CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）、CD4（+）/CD8（+）表达水平高低代表细胞免疫建立与否或免疫表达强弱， CD4（+）/CD8（+） 比例关系是机体免疫功能网络调控的重要枢纽，调控免疫进行的方向。本实验中脐血清CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）水平显著低于对照组（P＜0.01或＜0.05 ），CD4（+）/CD8（+）水平显著高于对照组（P＜0.01），表明脐血中T淋巴细胞免疫功能比健康成人低，因所采用的脐血均为正常足月健康新生儿脐血。分析其原因可能是脐血中的免疫细胞发育不成熟，抗原表达和功能活性低下所致。贾廷珍等［1］等研究认为新生儿脐血T 淋巴细胞发育不成熟， 多为幼稚细胞或处于“抑制”状态。通常胎儿循环血中的T淋巴细胞数量在妊娠中期逐渐增加，其CD4（+）/CD8（+）比例在出生时相对高于成人［2］。本研究结果显示，与健康成人相比，新生儿脐血T淋巴细胞亚群CD4（+）/CD8（+） 明显升高，此结果与既往部分研究结果一致，而与刘敬等［3］研究中发现的CD4（+）/CD8（+）倒置，新生儿脐血T淋巴细胞亚群分布与正常人无显著性差异结果不同。究其原因，主要是由于众多因素(包括种族、母体、胎龄等)可影响新生儿T淋巴细胞亚群分布有关［4］。其中有可能影响实验结果的因素包括：①实验设计的差异(包括检测方法、样本量大小)；②影响T细胞亚群的因素较多，如药物、心理活动变化等，T细胞亚群的变化有昼夜节律，抽取血样的时间对结果会有影响。今后当进一步扩大样本数量进行研究。

CD19（+）分布于除浆细胞外的B细胞谱系发育的各个阶段，是B细胞的重要标记，其功能类似于T细胞表面的CD4（+）、CD8（+），在B细胞活化及信号传导中起协同受体的作用，它调节B细胞的活化和增殖，为CR2复合体〔包括CD21（+）、CD19（+）、CD81（+）〕的成员，参与B细胞的信号传导。B细胞一方面可作为APC加工处理变应原而活化Th细胞，另一方面可接受其他APC提呈的抗原的刺激而活化。活化的B细胞特异性表面分子MHC、B7〔CD80（+）和CD86（+）〕等表达上调，MHC与B7分别和T 淋巴细胞表面受体分子TCR/CD3（+）及CD28（+）相结合，共同构成一对共刺激分子，产生胞内共刺激信号，使T细胞活化。B细胞的主要功能是产生抗体、提呈抗原及分泌细胞因子参与免疫调节等。CD10（+）分子主要分布B细胞膜上，是不成熟B细胞的协同刺激分子，恒定表达于B细胞，属于TNF受体家族。CD40（+）的配体CD40（+）-L与B细胞上的CD40（+）结合，诱导B细胞再次免疫应答及形成生发中心。CD23（+）在静止期的B细胞上不表达，在成熟B细胞上低表达，主要在活化的B细胞上表达，是激活B细胞亚群的表面标志。B细胞受到抗原刺激后分裂增殖，分化为浆母细胞，进而成熟为具有抗体生成能力的浆细胞，合成并分泌免疫球蛋白发挥体液免疫功能作用。本研究结果CD19（+）的表达与健康成人相比无显著性差异，许利民等［5］研究认为脐血中B细胞主要以不成熟B细胞亚群〔CD19（+）、CD10（+）〕为主。因此认为脐血中B细胞数量虽然与健康成人相比无显著性差异，但是B细胞不成熟或未活化，是脐血移植早期体液免疫功能低下的主要原因。
　　CD16+56（+）是自然杀伤细胞（NK细胞）的标志物，表达的量可能与NK细胞的数量或功能有关。NK细胞是机体防御体系的第一道屏障，是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素。NK细胞起源于CD34（+）造血细胞［6］，在骨髓微环境内发育成熟，幼稚型NK细胞在IL-2、IL-15和c-Kit配基等早期造血生长因子的作用下分化成熟，形成具有免疫活性的成熟型NK细胞。成熟型NK细胞分泌γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等先天性免疫调节因子，参与机体早期抗感染免疫反应，通过自然细胞毒性杀伤病毒感染细胞，通过FcrR Ⅲ受体与抗体Fc部分结合介导抗体依赖性细胞毒性作用。本研究结果显示，脐血中CD16+56（+） 的量和健康成人相比差异无显著性。脐血移植后抗感染、抗肿瘤作用弱，可能是因为脐血中的NK细胞以幼稚型为主，NK细胞未分化成熟从而不能发挥正常的免疫功能。
　　综上所述，我们认为脐血淋巴细胞免疫功能较健康成人低，部分原因是淋巴细胞发育尚不完全成熟或没有受到抗原刺激而活化，至于其他的因素尚需要进一步探讨。
【参考文献】
［1］ 贾廷珍，刘长安，杨 光.脐血基础与临床研究［J］.中华放射医学与防护杂志，2006，26（1）：10-14.

［2］ Lapolla A， Dalfra MG， Sanzari M， et al. Lymphocyte subsets and cytokines in women with gestational diabetes mellitus and their newborn［J］. Cytokine，2005，31(4):280-287.

［3］ 刘 敬，赵 莉，李 华，等.脐血免疫功能初步研究［J］.中华儿童保健杂志，1997，5（1）：6-7.

［4］ Cairo MS， Wagner EL， Fraser J， et al. Characterization of banked umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells and lymphocyte subsets and correlation with ethnicity， birth weight， sex， and type of delivery: a Cord Blood Transplantation (COBLT) Study report［J］. Transfusion，2005，45(6):856-866.

［5］ 许利民，冯 江，王 劲，等.脐血与成人骨髓淋巴细胞及其亚群比较［J］.现代免疫学，2005，25（1）：45-48.

［6］ Kim JP， Lee YH， Lee YA， et al. A comparison of the kinetics of nucleated cells and CD34+ cells in neonatal peripheral blood and cord blood［J］. Biol Blood Marrow Transplant，2007，13(4):478-485.

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