舟山眼镜蛇线粒体基因组全序列浅析

【摘要】 【目的】对2条舟山眼镜蛇的线粒体基因组全序列进行了测定和分析，并初步探讨其系统发育地位。【方法】结合PCR产物TA克隆和步移测序技术，基于除nad6外12个蛋白编码基因的合并序列及其翻译的氨基酸序列，以蜥蜴为外群，用NeighborJoining(NJ)法构建了7种蛇的系统发育树。【结果】两者在长度上仅相差2 bp，基因含量和排序完全一致，共编码37个基因(2个rRNA、22个tRNA和13个蛋白)，其中tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(UCN)、tRNAGlu、tRNAPro和nad6由轻(L)链编码，其他均由重(H)链编码。13个蛋白编码基因的排列次序和相对位置与其他蛇类完全一致，起始密码子除cox1使用GTG外，其余均为ATG;与此同时，除nad1/4L/5、cox1和atp8外，其他均为不完全的终止密码子TA或T。NJ树分析发现，眼镜蛇科与游蛇科亲缘关系最近，随后依次与蝰科和蟒科聚在一起，各分支的支持值均高达90%以上。【结论】本研究证实了基于全线粒体基因组合并序列进行蛇类物种系统发育研究是可行的。
【关键词】 舟山眼镜蛇;基因组学;控制区;系统发育;线粒体
　　舟山眼镜蛇，又叫“中华眼镜蛇”，拉丁名为“Naja atra”，英文名包括“Zhoushan cobra”、“Taiwan cobra”或“Chinese cobra”。其隶属于爬行纲(Reptilia)有鳞目(Squamata)蛇亚目(Serpentes)眼镜蛇科(Elapidae)眼镜蛇属(Naja)，主要分布于我国南部、台湾岛和越南北部，在《濒危野生动植物物种国际贸易公约(CITES)》附录中被列为Ⅱ级保护动物。
　　目前，GenBank中来自蛇类物种的核酸序列主要集中在蛇毒蛋白及代表性的核和线粒体基因片段，有关mtDNA全序列的报道则比较少。Kumazawa等[1]首次测定了“Dinodon semicarinatus”的线粒体基因组全序列，Dong等[2]继续测定了另外7种蛇的全序列，严洁[3]、李洪丹[4]和Jiang等[5]又提交了4种蛇的全序列。
　　为给保护生物学、进化遗传学和物种鉴定等相关领域的基础研究和实际应用提供帮助，本研究在测定舟山眼镜蛇线粒体基因组全序列的基础上，结合PCR产物TA克隆和步移测序技术，利用合并的12个重链(H链)编码的蛋白基因及其翻译的氨基酸序列组合数据，对蛇类物种的系统发育关系进行了初步的分析，现报道如下。
　　1材料与方法
　　11主要试剂及仪器离心柱型基因组提取试剂盒(北京天根公司，DP303型)，分子量标记(北京天根公司，DNA Marker III)，蛋白酶K(美国Amresco公司，批号：0706)，引物(北京赛百盛公司，人工合成)，脱氧核苷酸混合物(dNTPs)、PCR缓冲液和DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司，型号ExTaq)，T载体(大连宝生物工程有限公司，型号pMD18T)，大肠杆菌感受态细胞(北京索莱宝公司，DH5α)，PE2400型PCR扩增仪(美国Perkin Elmers公司)，3730XL型96道毛细管基因分析仪(美国ABI公司)，GDS8000型凝胶成像系统(美国UVP公司)，PowerPac Basic电泳仪(美国Biorad公司)、115K型高速冷冻台式离心机(美国Sigma公司)。
　　12样品来源和总DNA提取舟山眼镜蛇购于广州加雨蛇场，蛇全体标本经鉴定后保存于中国科学院成都生物研究所两栖爬行动物标本馆(样品凭证号：CIB093930和CIB093931，鉴定人：赵尔宓)。少量新鲜蛇肌肉组织立即使用或-80 ℃保存，总DNA提取参照DP303离心柱型基因组提取试剂盒提供的说明书进行。洗脱得到的DNA溶液经测定D260和D280粗略估计浓度和纯度后，稀释至100 ng/μL，分装于-4 ℃短期保存备用。
　　13引物设计、PCR扩增、TA克隆、步移测序和序列拼接参照GenBank公布的蛇类物种序列，采用生物信息学分析软件Clustal X 18进行多序列比对，在系统总结前人设计的通用引物的基础上，对部分引物进行了修改，最终筛选得到9对引物，扩增片段大小为15～3 kb，保证相邻片段间重叠大于200 bp(重叠率约为23%，数据待发表)。PCR扩增、TA克隆和步移测序具体步骤参见文献[6]。采用Seq ManII 71和Chromas 233分析软件对测序结果进行人工校对和拼接，得到舟山眼镜蛇线粒体基因组全序列。
　　陈念.舟山眼镜蛇线粒体基因组全序列分析第5期14基因定位、序列分析和提交以首次鉴定的半棱鳞链蛇线粒体基因组全序列(Dinodon semicarinatus;NC001549)为参照，结合tRNA ScanSE 121[7]定位了21个tRNA基因，随后通过Clustal X18分析软件进行多序列比对，对剩余的1个tRNASer(AGY)，以及所有的蛋白编码基因、rRNA基因和控制区进行了定位。采用Editseq 71软件统计序列总长、碱基组成和GC含量等信息。两个体的线粒体基因组全序列经Sequin 79软件注释后提交GenBank，登录号分别为EU913475(17 216 bp)和EU921898(17 214 bp)。
　　15系统发育分析参照GenBank上已全测序的另外6种蛇的12个(nad 6除外)线粒体蛋白编码基因及其翻译的氨基酸序列，分别采用MEGA 40软件[8]构建(NeighborJoining NJ)系统发育树。具体方法：将从GenBank数据库中下载的text文件通过Seq Verter 204格式转换合并为单个GenBank格式的文件，采用DAMBE 507软件筛选出蛋白编码基因并将其翻译成氨基酸序列，分别保存在word文档中，合并、去掉空格后转换为Clustal X 18多序列比对格式，经Bio Edit 70软件多序列比对后存为fasta格式并导入MEGA 40，随即利用上述比对后的蛋白编码基因序列(共10 220个位点)和氨基酸序列(3 548个位点)分别构建NJ一致树。参数：bootstrap=1 000次重复，删除空位(gaps)和丢失(missing)数据，各位点间的速率视为一致，且包含所有的变异。基因序列和氨基酸序列的统计分析分别采用“maximum composite likelihood”(包括转换和颠换)和“Poisson correction”取代模型。
　　2结果
　　21基因组结构简图舟山眼镜蛇线粒体基因组总长位于正常的脊椎动物线粒体基因组大小范围内(数据待发表)，两个体间仅相差2 bp。如图1所示，其基因组成、大小和排列次序与其他蛇类基本一致，包括2个rRNA基因、22个tRNA基因、13个蛋白编码基因和2个CR区。其H链碱基组成为：A=262%、C=305%、G=161%、T=272%。另外，舟山眼镜蛇的线粒体基因组在结构上十分紧凑，位于H链上的12个蛋白编码基因仅有2组的阅读框发生了重叠，分别是atp8-atp6(重叠10 bp)和nad5-nad6(重叠5 bp)。注：tRNA基因用对应的氨基酸单字母缩写表示;ND1～ND6为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶1～6亚基;COX1～COX3为细胞色素氧化酶1～3亚基;ATPase6/8为ATP酶复合物6和8亚基;Cytb为细胞色素b;12S/16S为核糖体小亚基(sr)RNA和大亚基(lr)RNA;CR为控制区;上、下方的基因分别代表由H和L链编码
　　图1线性化的舟山眼镜蛇线粒体基因组结构简图
　　Figure 1Linearized gene organization of the Chinese cobra mitochondrial genome
　　22不完全终止密码子舟山眼镜蛇(EU921898)线粒体基因组的精细结构特征如表1所示，总共13个蛋白编码基因中有9个使用不完全的终止密码子：其中一些基因通过在mRNA转录后添加poly A而形成完整的终止密码子TAA[9]，如cox2末端的“T”紧接着tRNALys的起始碱基“C”，nad4末端的“TA”紧接着tRNAHis的起始碱基“G”，cob末端的“T”紧接着tRNAThr的起始碱基“G”，等;另一些则可能存在其他的途径，如atp6末端的“TA”可能直接利用下游cox3的起始密码子“ATG”。值得一提的是，这些终止密码子在眼镜蛇科内部均非常保守，对舟山眼镜蛇、印度眼镜蛇(Naja naja，NC010225)和金环蛇(Bungarus fasciatus，EU579523)进行比较发现，所有蛋白编码基因的终止密码子除nad6外均完全相同。
　　23系统发育分析图2为基于12个线粒体蛋白的编码基因及其翻译的氨基酸序列合并数据构建的NJ系统发育一致树，可见基于上述2种不同的数据类型所构建的NJ树具有相同的拓扑学结构，仅部分分支的支持值存在差异。其中眼镜蛇科蛇(眼镜蛇和舟山眼镜蛇)、蝰科蛇(尖吻蝮蛇和冲绳烙铁头)和蟒科蛇(红尾蚺和球蟒)均形成各自独立的末端分支，各分支的支持值均大于90%。蟒科的2种蛇位于系统树的基部，是较原始的类群，眼镜蛇科和游蛇科具有较近的亲缘关系，两者与蝰科共同聚为一个大的单系类群，即“(眼镜蛇科+游蛇科)+蝰科”。注：节点处斜线(/)左侧和右侧的数值分别表示基因和氨基酸序列的bootstrap(重复1 000次)支持值
　　3讨论
　　线粒体基因组学研究对于揭示生物体遗传的奥秘具有重要的理论和实际意义：一方面，作为细胞的“动力工厂”， 线粒体通过氧化磷酸化作用提供生命活动所需的大部分能量，其呼吸功能的变化直接关系机体对氧气的利用效率，而参与线粒体呼吸和氧化磷酸化作用的多数元件又均由线粒体自带的遗传信息所编码，因此，线粒体基因突变与物种对氧环境的适应能力关系密切;另一方面，作为核外遗传物质，线粒体DNA与核DNA相比具有结构简单、母性遗传、拷贝数多、变异速率快和缺乏重组等特点，因而被作为动物分子系统发育和进化研究的重要工具，可忠实再现哺乳动物的母系进化史，且在遗传多样性、物种分类和法医鉴定等领域也有广泛的用途[10-11]。

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　　32NJ系统发育树我国共有200多种蛇类，隶属于8个科，由于研究方法上的差异，一直以来，有关眼镜蛇科、游蛇科和蝰科等蛇类关系的研究存在争议。从形态方面分析，眼镜蛇科和游蛇科的毒牙均为沟牙，两者与蝰科蛇的毒牙具有不同的起源。Heise等[13]基于12S rRNA和16S rRNA基因序列分析的结果也支持了上述观点。但是，由于单基因提供的信息量有限，近年来，研究者越来越倾向于使用较长的大片段合并序列进行系统发育学研究。本研究以蛇蜥科蜥蜴(Abronia graminea，Anguidae;NC005958)为外群，分别基于12个线粒体蛋白编码基因及其翻译的氨基酸序列的组合数据对4个科7种蛇类之间的亲缘关系进行了初步分析，所构建的NJ系统树支持了童宗中等[14]研究的结论，即眼镜蛇科较蝰科而言与游蛇科具有更近的亲缘关系，蟒科蛇类则是一种相对来说较原始的类群。
　　上述研究证实了基于全线粒体基因组合并序列进行蛇类物种系统发育研究的可行性。与此同时，有关我国其他重要蛇类物种的全线粒体基因组测序工作正在进一步进行中。
【

参考文献

】
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