【关键词】 缺血.，再灌注损伤，;胃;，一氧化氮;，凋亡;，增殖;，大鼠
摘要 :目的 研究内源性一氧化氮（nitric oxide，NO）对大鼠胃黏膜缺血.再灌注损伤的保护作用。 方法 采用大鼠胃缺血.再灌注（gastric ischemia.reperfusion，GI.R）模型（夹闭腹腔动脉30min后再灌注），通过组织学、免疫组化等方法，研究NO的前体物质左旋-精氨酸（L-arg）和NO合成酶抑制剂L-NG-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）对缺血.再灌注后大鼠胃黏膜细胞坏死、凋亡和增殖的影响。 结果 与GI.R组相比，L-arg组胃黏膜损伤明显减轻，胃黏膜损伤面积明显缩小，凋亡细胞减少，增殖细胞增加（P&<0.05）;L-NAME组与GI.R组相比胃黏膜损伤明显加重，胃黏膜损伤面积明显增加，凋亡细胞增加，增殖细胞减少（P&<0.05）。 结论 内源性NO对胃黏膜缺血.再灌注损伤具有保护作用。
关键词 :缺血. 再灌注损伤 ;胃; 一氧化氮; 凋亡; 增殖; 大鼠
Abstract:Objective To investigate the protective role of endogenous nitric oxide（NO）in gastric ischemia.reperfusion（GI.R）injury of rats.Methods The GI.R model was established by clamping the celiac artery for30min and allowing reper-fusion for3h.The effects of L-arginine（NO synthesis precursor）and N-nitro-L-arginine（L-NAME，NO synthetase blocker）on gastric mucosal cellular injury，apoptosis and proliferation were observed by using histological and immunohistoche-mical methods in SD rats.Results In the L-arginine group，the gastric mucosal cellular injury induced by GI.R was signifi-cantly alleviated，with the gastric mucosal injury area and apoptotic cells decreased and the proliferative cells increased（P&<0.05）.However，In the L-NAME group，the gastric mucosal cellular injury was significantly aggravated，showing increase of gastric mucosal injury area and number of apoptotic cells and decrease of proliferative cells（P&<0.05）.Conclusion The en-dogenous nitric oxide plays a protective role against gastric ischemia.reperfusion injury in rats
Key words:ischemia.reperfusion injury;stomach;nitric oxide;apoptosis;proliferation;rats
胃缺血.再灌注（gastric ischemia.reperfusion，GI.R）后可引起胃黏膜组织一系列病理生理改变，造成胃黏膜组织功能和形态学的病理性改变。缺血.再灌注损伤的机制目前主要认为是氧自由基损伤、ATP酶水解及细胞凋亡等［1～3］ 。一氧化氮（nitric ox-ide，NO）是近年来发现的一种生物活性物质，能舒张毛细血管，改善微循环灌注，降低血管通透性，减轻组织水肿，抑制白细胞与血管内皮黏附等作用，可参与介导体内多种生理和病理反应过程。目前有报道 表明该物质具有胃黏膜保护功能［4］ ，但对于GI.R造 成的胃黏膜损伤是否具有保护作用尚不明确。
目前虽然对GI.R引起的胃黏膜细胞损伤的研究资料较多，但绝大多数的研究者对GI.R仍局限在对其组织学的观察（如胃黏膜损伤面积、损伤程度等），而对GI.R引起的胃黏膜细胞的凋亡和增殖研究较少［5～7］ 。
本次实验，我们通过研究NO的前体物质L-精氨酸（L-arg）和NO合成酶抑制剂L-NG-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）对缺血.再灌注后大鼠胃黏膜细胞坏死、凋亡和增殖的影响，以期阐明内源性NO对胃黏膜的缺血.再灌注损伤是否具有保护作用。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 M30CytoDEATH小鼠单克隆抗体，来自Roche公司;小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体、PowerVisionTM 二步法免疫组化检测系统、联苯二胺（DAB）显色试剂盒，来自北京中山生物技术有限公司;L-NAME、L-arg来自Sigma公司。
1.2 实验动物和分组 成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重（250±25）g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。实验前禁食24h、自由饮水。大鼠随机分为3组（n=6）:GI.R组、L-NAME组（L-NAME+GI.R）、L-arg组（L-arg+GI.R）。L-NAME和L-arg用生理盐水配制，分别按L-NAME12mg.kg、L-arg200mg.kg（参考有关文献及预实验结果），于手术前20min一次性腹腔注射。
1.3 GI.R模型的制备 按Zhang等8］ 方法。实验时用戊巴比妥钠40mg.kg腹腔麻醉。麻醉完全后将动物仰卧固定于手术台上，剪毛，开腹，分离并夹闭腹腔动脉30min，去除动脉夹恢复血流。于再灌注后3h快速取胃。
1.4 胃黏膜损伤程度测定 参照闫长栋等［9］ 方法。胃取出后沿大弯侧剪开，用冰冷的0.1mol.L PBS冲洗，在冰盘上展平，置方格计数板（每一方格面积为1mm 2 ）快速测量损伤情况。以腺胃区局限于胃上皮的点状、片状、条索状糜烂、溃疡、出血灶的面积占腺胃区黏膜总面积的百分数作为胃黏膜损伤程度的指标。
1.5 苏木精-伊红染色观察胃黏膜的损伤 测量完损伤程度的胃组织固定在Bouin固定液中固定 4h，常规脱水，透明，石蜡包埋，5μm切片，间隔 45μm贴片于用多聚赖氨酸处理的载玻片上，常规苏木精-伊红染色，在Olympus光学显微镜下观察GI.R后胃黏膜的损伤和修复。
1.6 免疫组织化学染色法观察胃黏膜细胞的凋亡和增殖 M30CytoDEATH染色步骤严格按照Roche公司提供的说明书进行;PCNA染色步骤按照北京中山生物技术有限公司提供的PowerVision TM 二步法免疫组化检测系统进行。DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。光镜下观察到胞质或胞核内有棕色颗粒者，即为阳性细胞。用Leica Qwin图像分析系统对阳性细胞数进行半定量分析。以高倍或低倍视野下阳性细胞数占整个视野细胞总数的百分比作为分析指标。对照实验以PBS缓冲液代替一抗。每例3张间断切片，每张切片随机选取10个视野，取平均值。
1.7 统计学处理 数据以ˉx±s表示，成组设计的2组间均数比较采用t检验，多组均数与同一均数的比较采用方差分析（ANOVA），P&<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 L-arg和L-NAME对胃黏膜损伤程度的影响 GI.R组胃黏膜损伤面积百分比为（21.00±5.63）%。L-arg组胃黏膜损伤面积百分比降为（12.46±2.32）%，与GI.R组相比有显著性差异（P&<0.05）;L-NAME组为（27.75±5.32）%，较GI.R组明显增加（P&<0.05）。
2.2 光镜下观察胃黏膜损伤程度 GI.R组黏膜下层水肿，黏膜层糜烂、出血，细胞脱落;L-arg组有明显的黏膜及黏膜下层水肿，但糜烂仅限于黏膜上层，出血较少;L-NAME组黏膜及黏膜下层充血水肿，出现深达黏膜中下层的糜烂、出血（图1）。
2.3 免疫组化染色观察L-arg和L-NAME对胃黏膜凋亡阳性细胞的影响 各组胃黏膜的M30Cy- toDEATH阳性细胞（即凋亡阳性细胞）主要散在表达于黏膜中上层，黏膜层基底部也有少量表达。L-arg组凋亡阳性细胞百分比为（3.24±0.89）%，L-NAME组为（8.38±1.47）%，分别是GI.R组的0.56倍和1.44倍，与GI.R组相比有显著性差异（P&<0.05）（图2）。
2.4 免疫组化染色观察L-arg和L-NAME对胃黏膜增殖阳性细胞的影响 各组胃黏膜PCNA阳性 细胞（即增殖阳性细胞）均表达在黏膜层上中1.3交界处附近。GI.R组增殖阳性细胞百分比为（8.64±1.46）%，L-arg使增殖阳性细胞百分比增加至（13.28±2.74）%，而L-NAME组增殖阳性细胞百分比降为（5.93±1.83）%，与GI.R组相比均有显著性差异（P&<0.05）（图3）。 3 讨 论
NO是目前研究最多，舒张血管作用最强的一种内皮舒张因子，具有扩张血管、抑制平滑肌细胞增殖及抗血小板凝集的作用，并在调节胃肠道黏膜的血流量及保持黏膜完整的屏障作用中具有重要意义［10-11］ 。NO由NO合成酶分解其特异性底物L-arg产生。本实验发现，给予NO合成前体L-arg可以明显减轻缺血.再灌注引起的胃黏膜损伤，胃黏膜损伤面积明显减小，增殖细胞增加，凋亡细胞减少;相反的，给予NO合成酶抑制剂L-NAME使胃黏膜损伤加重，增殖细胞减少，凋亡细胞增加，表明内源性NO对胃黏膜缺血.再灌注损伤具有保护作用。
关于NO的胃黏膜保护机制，Kim等发现缺血.再灌注能增加胃黏膜脂质过氧化物的产生，并且使胃黏膜谷胱甘肽、cGMP和黏液量减少，同时谷胱甘肽过氧化物酶和NO合成酶活性降低，表明NO对胃黏膜具有抗氧化的防御作用［12］ 。另外，胃黏膜血流的影响也是NO胃黏膜保护机制的重要因素之一［13］ ，这是因 为人体内90%的NO来源于血管内皮，研究发现内皮细胞产生的NO可通过血管平滑肌细胞膜，激活细胞内可溶性鸟苷酸环化酶，合成cGMP，后者通过调节蛋白激酶、磷酸二酯酶舒张血管平滑肌，扩张血管［14］ 。由于静脉平滑肌对NO敏感性高于动脉，因此最终导致微循环阻力下降，局部血供增加，加速毒性物质的清除，增强胃黏膜对损伤因子的抵抗能力。至于内源性NO在GI.R中是如何发挥保护作用的，其细胞分子机制如何，我们将做进一步的研究。
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