作者：陈海英 孔月红 蔡兆明
【关键词】 衰老;，木犀草素，;分布;淋巴细胞转化;超氧化物歧化酶;，丙二醛;，大鼠
摘要 :目的 探讨不同年龄胸腺细胞在胸腺内区域性分布的形态学变化，研究木犀草素对衰老大鼠胸腺形态学及免疫功能和抗氧化能力的影响。 方法 大鼠按年龄分组及治疗组，在光镜和电镜下观察各组大鼠胸腺细胞在胸腺内分布的增龄改变，并分别测定淋巴细胞转化功能和抗氧化功能。 结果 在光镜和电镜下观察到木犀草素对老年胸腺细胞区域性分布及部分凋亡细胞的保护逆转。能增加实验性衰老模型大鼠胸腺指数，增强淋巴细胞转化能力，明显提高血清超氧化物歧化酶水平并降低脂质过氧化物含量。 结论 木犀草素具有正向免疫调节作用。
关键词 :衰老;木犀草素;分布;淋巴细胞转化;超氧化物歧化酶;丙二醛;大鼠
Abstract:Objective To study the morphologic changes with age in thymocytes and to explore the effect of luteolin on the aging changes in thymocyte morphology，immunity and anti-oxidation activity in aged mice.Methods The rats were hosted in three age groups（1-week，8-week and20-month）and an aged（20-month）group under luteolin treatment.The ul-trastructure and distribution of thymocytes were studied under high power microscope and electron microscope.The immunologic and antioxidant functions were estimated.Results Luteolin could protect against or converse the aging effects on thymocytes in aged rats:obviously increasing the thymus index，inhibiting thymocyte apoptosis，promoting splenolymphocyte proliferation，in-creasing the activity of serum superoxide dismutase（SOD）and decreasing the content of serum malondialdehyde（MDA）.Con-clusion Luteolin can positively regulate immunologic function.
Key words:aging;luteolin;lymphocyte transformation;superoxide dismutase;malondialdehyde;rats
木犀草素的生物化学及药理作用具多样性，具有明显抗炎、抗过敏、抗衰老的作用［1］ 。人类胸腺在发育早期随着年龄增长而增大，青春期以后胸腺在形态上表现为明显萎缩，在功能上表现为免疫功能衰退。本实验观察不同月龄大鼠的胸腺细胞在胸腺内区域性分布的形态学变化，探讨其免疫功能低下的形态学基础;并通过予老龄大鼠木犀草素灌胃，观察其对胸腺细胞区域性分布及衰老指标的逆转程度，探讨木犀草素制剂对老年大鼠胸腺细胞免疫功能的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 SD大鼠40只，由福建医科大学实验动物研究室提供，动物合格证号:闽实动质准第002-05号。植物血凝素（PHA）、四甲基戊唑蓝（MTT）、木犀草素由Sigma公司提供，超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供。
动物分4组，每组10只。幼年组:1周龄，正常饮水及饲料;青年组:8周龄，正常饮水及饲料;老年组:20月龄，正常饮水及饲料。治疗组:20月龄，正常饮水及饲料，同时20mg.（kg・d）木犀草素连续灌胃给药，每天1次，连续喂养8周。
1.2 胸腺和脾脏指数测定 戊巴比妥腹腔麻醉，取出胸腺和脾，电子天平分别称湿重（湿质量），以克为单位，体质量以克为单位，然后计算胸腺指数=100 ×胸腺重量.体重（mg.10g）。
1.3 脾脏淋巴细胞增殖实验 无菌制备脾细胞悬液，将细胞液加入24孔培养板，细胞数5Ⅹ10 6 个.孔，培养板置于37℃，5%CO2 孵箱中培养48h，应用PHA诱导，以MTT比色分析法620nm处酶标仪测定吸收度的大小。
1.4 SOD、MDA测定 下腔静脉取血，肝素抗凝，取血清检测。具体步骤按测试盒说明进行。
1.5 光、电镜标本的制备 摘取部分胸腺组织，以10%甲醛溶液固定，进行石蜡切片，苏木精-伊红染色，光镜放大10×40倍观察并照相。紧贴胸腺被膜即皮质切成1mm 3 小块固定于2%戊二醛溶液，反复洗涤后用1%锇酸溶液作后固定，乙醇系列脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀与柠檬酸铅染色，H-600型电子显微镜观察与照相。
1.6 统计学处理 各项数据以ˉx±s表示，进行t检验，以P&<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 大鼠胸腺指数的变化 由表1可以看出，老年组大鼠胸腺指数随着月龄的增加出现明显下降（P&<0.01），而治疗组胸腺指数与老年组相比有明显逆转（P&<0.01）。
2.2 脾脏淋巴细胞增殖实验结果变化 表1显示，与青年组相比较，老年组淋巴细胞转化率（淋转）有明显下降（P&<0.05），而治疗组较老年组有明显逆转（P&<0.01）。 表1 各项指标测定情况与幼年组比较:**P&<0.01;与老年组比较:##P&<0.01 2.3 SOD与MDA测定 表1显示，与青年组相比 较，老年组的血清SOD活性有明显下降，MDA含量 则呈上升趋势（P&<0.01）。而治疗组的SOD较老年组有大幅度上升，MDA含量则较老年组明显减少（P&<0.01）。
2.4 光、电镜结构观察
2.4.1 大体观察 各组胸腺外形极不规则，多分叶。
2.4.2 光镜观察胸腺皮、髓质面积和两者之比测定分析 见表2。皮髓质面积比例大小表示皮质萎缩、变薄的程度。测定结果分析显示，青年组与幼年组皮髓质面积比例存在一定差异（P&<0.05），青年组胸腺皮质薄、髓质相应较大;老年组皮、髓质分界不清，胸腺皮质明显萎缩退化。治疗组的皮髓质面积比例与老年组比较差异显著（P&<0.05）。
2.4.3 胸腺细胞分布及数量 见表2。同一部位的切片使用IPP图像分析软件在光镜下于每一切片的皮质区域随机选取10个视野，计数胸腺细胞。显示各组胸腺周边（皮质）被膜下胸腺细胞密集，大小一致;上皮性网状细胞散在。而每组的中间部（皮、髓质交界）胸腺细胞排列较松散，老年组胸腺此处出现凋亡现象。胸腺小叶间隔变宽，结缔组织增多，皮质明显变薄、髓质更加扩大，皮、髓质分界不清。胸腺细胞稀疏排列，细胞周缘模糊，部分细胞被脂肪、纤维组织所代替;部分胞核有固缩、凋亡现象;凋亡细胞与周围细胞分离，上皮性网状细胞相对增多，但明显退化。治疗组胸腺皮质较老年组增厚，胸腺细胞密集。 表2 大鼠胸腺皮髓质比例、皮质细胞数的随龄变化与幼年组比较:*P&<0.05，**P&<0.01;与老年组比较:#P&<0.05
2.4.4 电镜下胸腺细胞分布与结构变化 幼年组被膜内侧皮质浅层细胞排列紧密，近髓质区域细胞较小，细胞圆形或卵圆形，胞内游离核糖体较多。上皮性网状细胞细胞体形大而发达，向深部组织延伸，甚至包绕周围的胸腺细胞（图1）。
青年组上皮性网状细胞细胞器不发达，张力细丝束较多及少量的空泡，核较大;突起间可见桥粒连接成网孔，网孔中充满胸腺细胞。细胞排列松散，失去了与上皮细胞间的紧密接触［7］ 。部分细胞内内质网增生肿胀扩张呈囊泡状（图2）。
治疗组经木犀草素治疗后，胸腺小叶内皮质、髓质分界清晰，皮质厚度明显增加，细胞密度增大。与老年组比较，衰老凋亡结构有不同程度的改善，接近青年组的组织结构。纤维化程度减轻，小叶间隔变窄。电镜下胸腺细胞、上皮性网状细胞及巨噬细胞内的细胞器丰富完整，线粒体轻度出现肿胀变性等现象，而粗面内质网、滑面内质网分布正常（图4）。
3 讨 论
胸腺上皮性网状细胞群及其分泌的胸腺素等激素在胸腺内形成功能不同的局部微环境，以旁分泌作用或细胞与细胞之间的相互作用分别在胸腺细胞发育的不同阶段发挥相应的生物学作用。衰老破坏了上皮性网状细胞与胸腺细胞相互依赖生存的微环境，从而导致胸腺细胞增殖障碍与分布异常，并影响胸腺细胞的选择，使细胞发生凋亡导致胸腺萎缩退化。胸腺中间部（皮、髓质交界）大部分的胸腺细胞将通过凋亡被清除，少量通过循环管道进入外周淋巴器官 ［2］ ，于是镜下看到皮、髓质交界处细胞排列松散，凋亡细胞主要位于该交界处。有报道衰老过程胸腺细胞在胸腺内的分裂增殖率下降，即增殖阻滞;意味着不能有足够数量的细胞及时更换丢失死去的细胞，从而导致胸腺随增龄逐渐萎缩。胸腺细胞在其发育分化过程中90%以上的胸腺细胞发生凋亡，只有3%～5%的胸腺细胞最终发育为成熟的处女型T细胞［3］ 。
本实验结果显示，老年组大鼠胸腺结构退化显著;其胸腺厚度、皮质细胞数等减少;细胞内线粒体变化最显著，主要出现肿胀变形、嵴变短减少，线粒体结构的退化影响生物氧化的进行，特别是能量代谢受阻，势必导致细胞功能障碍［4］ ，出现细胞结构萎缩或凋亡，而治疗组均可明显增加胸腺皮质厚度、皮质细胞数 ［5］ ，其光镜结构、电镜胸腺内细胞衰老、凋亡现象有所减轻。
随着年龄增大，大鼠体内过氧化使细胞内含量丰富的多不饱和脂肪酸在代谢氧化过程产生对机体有损害的物质，其终产物MDA亦可加重细胞的功能和结构受损，过氧化脂质、自由基增多是机体产生衰老的主要因素。本实验测得SOD活力降低，脂质过氧化亢进，过氧化终产物MDA增多，胸腺的退化导致SOD的活性降低和MDA浓度增高，其中的因果关系尚待进一步研究。黄酮类化合物木犀草素的过氧化物酶的活性已有报道［6］ ，其中木犀草素可能阻断氧化过程，使过氧化脂质含量降低;木犀草素富含的维生素可明显提高衰老大鼠血清SOD水平，降低由于衰老引起的血清相关指标，如MDA。 胸腺T细胞受衰老影响很大，其成熟与增殖能力均因衰老而受抑制，老年组具有免疫功能的T细胞为青年组的50%～80%，随着增龄T细胞功能低下还表现为丝裂原PHA的增殖反应能力下降，且T细胞反复分裂能力下降，免疫功能下降。有报道称 木犀草素主要通过抑制炎症和免疫反应对抵抗感染SARS病毒曾发挥了一定作用［7］ ，本实验观察到木犀草素减缓胸腺的增龄性衰老，增强免疫作用，对免疫正向调节、维持机体的正常免疫功能起着重要作用［8］ 。
参考文献 :
［1］ Xagorari A，Papapetropoulos A，Mauromatis A，et al.Luteolin inhib-its an endotoxin-stimulated phosphorylation cascade and proinflamma-tory cytokine production in macrophages［J］.J Pharmacol Exp Ther，2001，296（1）:181-187.
［2］ 杜伯雨，姚振江，李 蓉.胸腺增龄性萎缩的机理及其逆转［J］. 中国免疫学杂志，2002，18（2）:143-145.
［3］ Doria G，Frasca D.Ageing and genetic control of immune responsive- ness［J］.Immunol Lett，1994，40（3）:231-233.
［4］ 苗明三，方晓艳.五味子多糖对正常小鼠免疫功能的影响［J］.中国中医药科技，2003，10（2）:100.
［5］ 韩 澎，崔亚君，郭洪祝，等.密蒙花化学成分及其活性研究［J］.中草药，2004，35（10）:1086-1090.
［6］ 陈海英，孔月红，蔡兆明.健康大鼠衰老指标的增龄变化及形态学基础的相关性研究［J］.山西医科大学学报，2005，36（5）:537-539.
［7］ Peiris JS，lai ST，Poon LL，et al.Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome［J］.Lancet，2003，361（9366）:1319-1325.
［8］ 刘彦平，毛辉青，李 萍，等.枸杞多糖对小鼠T淋巴细胞亚群和淋巴细胞转化作用的研究［J］.青海医学院学报，2000，21（4）:4-6