慢性乙型肝炎患者CD4.CCR5、CD4.CD30细胞亚群失衡分析

【关键词】 慢性乙型肝炎;，辅助T细胞亚群
　　 摘要 :目的 研究辅助性T细胞亚群（Th）在慢性乙型肝炎（CHB）发病机制中的作用，寻找治疗CHB的新方法。 方法 用流式细胞仪对20例正常人（NC组）及20例CHB患者外周血单核细胞（PBMC）经植物血凝素（PHA）培养前后的Th1、Th3水平进行了检测，Th1、Th3细胞表面特异性标志分别为CD4.CCR5、CD4.CD30。 结果 培养前，Th1在NC组与CHB组无明显差别（P&>0.05），CHB组Th3明显高于NC组，同时CHB组及NC组Th1均明显高于Th3（P&<0.05）;培养后，NC组的Th1较培养前明显减少（P&<0.05），而NC组的Th3、CHB组的Th1及Th3较培养前均明显增加（P&<0.05），而以CHB组的Th3增加更明显;培养后，CHB组Th1、Th3均高于NC组（P&<0.05），而CHB组及NC组的Th1与Th3之间则无明显差别（P&>0.05）;培养前CHB组明显低于NC组（P&<0.05），而培养后CHB组高于NC组（P&<0.05），2组培养后Th1.Th3均明显低于培养前（P&<0.05）。 结论 CHB患者体内Th细胞亚群的应答模式与正常人群存在一定的差异;Th1向Th3细胞的漂移与乙型肝炎的慢性化及反复肝损伤有一定的关系。
　　关键词 :慢性乙型肝炎;辅助T细胞亚群
　　Abstract:Objective To investigate the roles of T helper（Th）cell subtypes in the pathogenesis of chronic hepatitis B（CHB）to help find new therapies for CHB.Methods The expression levels of CD4.CCR5（Th1）and CD4.CD30（Th3）of PMBC were assayed by flow cytometry in20CHB patients and20normal controls（NC）before and after PHA cultivation.CD4.CCR5and CD4.CD30are the specific cell surface markers for Th1and Th3respectively.Results Before cultivation，there was no discrepancy in Th1between NC and CHB（P&>0.05）;Th3was higher in CHB than in NC;and Th1was higher than Th3in both CHB and NC（P&<0.05）.After cultivation，Th1was decreased，but Th3was increased in NC;while Th1and Th3were both increased greatly in CHB，especially Th3（P&<0.05）.Th1and Th3in CHB were both higher than those in NC.There was no discrepancy between Th1and Th3in NC or CHB.There was no discrepancy in the value of Th1.Th3ratio between NC and CHB before cultivation，but after cultivation，Th1.Th3in CHB was higher than that in NC，and became lower in both groups than before cultivation.Conclusion Th subtype responsive model of CHB is different from that of NC;a shift of Th1cells toward Th3cells might play some roles in the pathogenesis of chronic viral hepatitis and liver damage.
　　Key words:chronic hepatitis B;T helper subtype
　　辅助性T细胞（T helper，Th）亚群Th1.Th3细胞在宿主抵御乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染中的作用近来备受关注［1～3］ ，国外研究发现乙型肝炎（hepatitis B，HB）发病机制与Th1.Th3细胞失衡有关。急、慢性HBV感染的抗HBV应答分别由不同的Th细胞亚群占主导地位:急性自限性HBV感 染者Th1细胞亚群占主导地位，促进细胞免疫应答，促进MHC-Ⅰ类和Ⅱ类分子表达，扩大免疫应答的识别相，活化单核-巨噬细胞及其效应细胞，刺激其细胞毒活性，借助于分泌的细胞因子进一步增强细胞免疫应答;而慢性HBV感染者Th3细胞免疫占主导地位，抑制细胞免疫而增强体液免疫，从而不利于病毒的清除或部分导致了病毒在细胞间的扩散，使HBV感染得以持续［1～3］ 。为了研究Th细胞亚群在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）发病机制、预测预后、指导临床治疗中的作用及意义，本研究用流式细胞仪检测了代表Th细胞特异性的细胞表面双标志物Th1（CD4.CCR5-细胞趋化因子受体5）、Th3（CD4.CD30），现将结果报道如下。
　　1 资料和方法
　　1.1 研究对象和分组 20例CHB患者来自2000年1月―2000年9月徐州医学院附属医院传染科门诊及住院患者，其中男性12例，女性8例，年龄18～55岁，CHB诊断依据2000年西安第10次全国病毒性肝炎会议制定的诊断标准进行。20例健康人为对照（NC组），其中男性16例，女性4例，年龄34～45岁。
　　1.2 标本的收集与处理 无菌采集静脉血5ml，4ml经肝素抗凝，用于淋巴细胞的分离培养，1ml用EDTA抗凝，直接用于流式细胞仪检测。
　　1.3 细胞培养与收集 常规分离外周血单个核细胞（PBMC），Hanks液洗3次，10%FCS-1640培养液调细胞溶液浓度为2×10 9 .L，接种于24孔细胞培养板，每孔1ml。做3个复孔。用植物血凝素（PHA）诱导其增殖，PHA终浓度为200mg.L，置37℃、5%CO 2 孵箱中培养48h，收集上清液置-20℃保存待测。培养后的细胞用PBS洗涤2次，最后用200μl PBS悬浮，待用。
　　1.4 流式细胞仪检测 CCR5、CD30、CD4的抗体购自深圳晶美公司。将相应抗体分别加入2只空白离心管中，分别为阳性管和阴性管，每管各加入抗凝外周血或培养后的细胞悬液100μl，充分混匀，4℃避光反应20min。在全血样本管中加溶血剂1ml，混匀放置5min。PBS洗涤，全血样本洗3次，培养管洗1次，沉淀用200μl PBS悬浮，上流式细胞仪检测。
　　1.5 统计学处理 所有数据采用ˉx±s表示，2组间比较用t检验，检验水准:α=0.05。
　　2 结 果
　　2.1 培养前2组Th1、Th3比较 培养前，Th1在NC组与CHB组间无明显差别（P&>0.05），CHB组的Th3明显高于NC组（P&<0.05），同时CHB组及NC组Th1均明显高于Th3（P&<0.05）。见表1。
　　2.2 培养后2组Th1、Th3比较 培养后，NC组的Th1较培养前明显的减少（P&<0.05），而NC组的Th3、CHB组的Th1及Th3较培养前均明显增加（P&<0.05），而以CHB组的Th3增加更明显。培养后，CHB组Th1、Th3均高于NC组（P&<0.05），而CHB组及NC组的Th1与Th3之间则无明显差别（P&>0.05）。见表1。
　　2.3 培养前后2组Th1.Th3比较 培养前CHB组Th1.Th3明显低于NC组（P&<0.05），而培养后CHB组高于NC组（P&<0.05），2组培养后的Th1.Th3均明显低于培养前（P&<0.05）。见表1。 表1 CHB患者Th细胞亚群与Th3比较:*P&<0.05;与培养前比较:#P&<0.05;与NC组培养后比较:ΔP&<0.05 　　3 讨 论
　　近年来的免疫学研究［1～7］ 发现:根据Th分泌细胞因子的不同，可将其分为Th0、Th1和Th3细胞，Th1细胞产生IL-2、γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-β（TNF-β）;Th3细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10。Th1和Th3细胞的功能差异与其所分泌 的细胞因子不同有关。Th1细胞主要功能为促进细胞免疫反应和细胞毒性T细胞（CTL）应答，清除细胞内细菌和病毒，介导细胞免疫应答;Th3细胞则辅助B细胞分泌抗体，主要促进体液免疫反应，中和细胞外病原体。此外，Th1、Th3细胞的分泌产物可相互下调两者的生长分化。
　　长期以来，由于缺乏特异性高且操作方便的Th1.Th3细胞标志物，给开展Th细胞亚群在病毒性肝炎发病机制作用的研究带来诸多不便。目前，国内外绝大多数对Th细胞亚群的研究是从测定血清中Th1、Th3分泌的细胞因子的结果推测出来的，而代表Th细胞亚群的细胞因子并非由Th1、Th3单独分泌，即血液中其他免疫细胞亦可分泌相应的细胞因子，故用Th1、Th3细胞所分泌的IFN-γ.IL-4的比值来推测Th1/Th3细胞比例存在一定误差，而且也不能反映出Th1及Th3细胞的实际比例及体内Th1、Th3的实际含量。国外已有研究8-9］ 发现，2种细胞表面标志物CCR5、CD30分别与激活的Th1、Th3细胞密切相关。CCR5、CD30分别表达于Th1、Th3细胞。我们用流式细胞仪检测了代表Th细胞特异性的细胞表面双标志物CD4.CCR5、CD4.CD30，研究了Th1、Th3细胞亚群在CHB发病机制中的作用，结果发现:培养前后CHB组Th3均明显高于NC组;同时培养后，CHB组的Th1及Th1.Th3也明显高于NC组。提示:CHB患者体内Th细胞亚群的应答模式与正常人群存在一定的差异;Th1向Th3细胞的漂移与HB的慢性化及反复肝损伤有一定的关系。
　　在HBV感染的早期，由于机体缺乏特异性的体液免疫，故清除HBV主要是来源于非特异性的体液免疫及CTL、自然杀伤细胞等细胞免疫的非特异性的杀伤作用。一旦HBV感染后形成持续感染的状态，要想彻底将其清除，就必须依赖特异性的体液免疫和细胞免疫两方面的共同作用，缺乏其中任何一方面的作用或两者的作用不平衡都无法彻底清除病毒。机体清除HBV感染的过程首先依赖于细胞免疫，主要是CTL细胞，使细胞内的HBV脱离了其赖以生存的肝细胞的胞内环境，同时健康的肝细胞能在胞内HBV释放到胞外之前建立抗HBV状态，胞外的HBV便不能进入健康的未曾被感染的肝细胞而被体液免疫中和，导致HBV感染难以持续。Th1主要有利于细胞免疫的加强，而Th3则有利于体液免疫的加强，我们的研究结果提示:CHB患者体内Th细胞亚群的应答模式与正常人群存在一定的差异，CHB患者体内的Th3占优势不利于HBV的清除。
　　与传统检测项目不同，检测Th1/Th3细胞或 Th1/Th3相关细胞因子的意义，并不侧重于辅助疾 病的诊断，而更注重分析疾病发生发展的状况，为临床调整Th1/Th3失衡提供正确的预防、治疗措施，故开展这方面的研究具有很大的实用价值。已有报道，通过采用直接针对Th1、Th3细胞功能与分化的细胞因子来调整Th1.Th3细胞效应的平衡，最终达到治疗肾脏疾病、自身免疫性疾病、习惯性流产等疾病。我们相信，不久的将来，可通过用调整Th细胞亚群失衡的方法来治疗部分CHB患者，为CHB的治疗提供新的途径。
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