【关键词】 :吡柔比星;，HL-60细胞;细胞凋亡，;核因子-κB，p65
摘要 :目的 研究吡柔比星（perarubicin，THP）对髓系白血病细胞系HL-60细胞凋亡与核因子-κB p65（nucle-ar factor kappa B p65，NF-κB p65）活性的影响。 方法 指数生长期HL-60细胞置于96孔培养板内RPMI1640培养液培养2h后，分为两部分，第1部分又分为A、B2组。A组加PBS液继续培养12h，B组分别加1、10、100μmol.L（终浓度）的THP继续培养12h;用DNA梯状凝胶电泳法（DNA ladder electrophoresis）和流式细胞检测技术（flow cy-tometry，FCM）分别检测HL-60细胞的凋亡率。第2部分也分为A、B2组，A组加PBS液继续培养3h，B组分别加1、10、100μmol.L（终浓度）的THP继续培养3h;用FCM检测NF-κB p65活化率。 结果 1、10、100μmol.L的THP诱导HL-60细胞的凋亡率分别为（31.78±4.31）%、（47.25±5.27）%、（56.49±1.59）%，组间及与对照组（6.46±1.45）%比较差异有统计学意义（P&<0.05）;诱导的HL-60细胞NF-κB p65活化率分别为（16.21±1.20）%、（23.98±3.21）%、（32.44±2.89）%，组间及与对照组（8.44±2.20）%比较差异有统计学意义（P&<0.05）。DNA梯状凝胶电泳Ladder出现从多到少的顺序为:100μmol.L THP、10μmol.L THP、1μmol.L THP、对照组。 结论 THP在促进HL-60细胞凋亡的同时有诱导其NF-κB p65活化的作用，均存在剂量依赖。
关键词 :吡柔比星;HL-60细胞;细胞凋亡;核因子-κB p65
Abstract:Objective To explore the effects of pirarubicin（THP）on the apoptosis and the activity of nuclear factor kappa B p65（NF-κB p65）of HL-60cells.Methods The experiment was carried in two parts.In the first part，after being cul-tured in RPMI1640for2h，the HL-60cells were pided into A and B groups to continue the culture for another12h，with PBS added in the media of group A，and THP1，10and100μmol.L added in the media of the respective B subgroups.The ap-optosis of HL-60cells was determined by DNA ladder electrophoresis and flow cytometry（FCM）.In the second part，The cells were grouped and cultured in the way similar to that in the first part，except for that the cultures were continued for another3h before the activation of NF-κB p65of HL-60cells was determined by FCM.Results The rates of apoptosis of HL-60cells induced by THP1，10and100μmol.L were（31.78±4.31）%，（47.25±5.27）%and（56.49±1.59）%，respectively，higher than the control（6.46±1.45）%，P&<0.05;and the rates of activation of NF-κB p65were（16.21±1.20）%，（23.98±3.21）%and（32.44±2.89）%，respectively，higher than the control（8.44±2.20）%，P&<0.05.Conclusion THP increases the apoptosis，and at the same time，promotes the activation of NF-κB p65of HL-60cells in dose-dependent manner.
Key words:pirarubicin;HL-60cells;apoptosis;nuclear factor-κB p65
急性白血病是儿童最常见的恶性肿瘤。目前治疗儿童白血病的方法主要是化疗，随着化疗方案的不断改进、新药的研发和用于临床，小儿白血病的预后已有非常明显的进步，然而复发和耐药一直困扰 着医务工作者。吡柔比星（THP）属蒽环类化疗药 物，它是阿霉素（ADM）的衍生物，是在ADM的4′位上加上一个四氢吡喃基，治疗白血病作用强于ADM，而心脏毒性明显小于ADM，因而近年来被广泛应用于临床，但它对白血病细胞影响的机制目前尚无定论。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器 HL-60细胞购自中国医学科学院医学基础研究所，兔抗人核因子-κB p65（NF-κB p65）单克隆抗体（一抗）、羊抗兔单克隆抗体（二抗）购自北京莱博生物实验材料有限公司，THP购自深圳万乐药业有限公司，DAN电泳试剂盒购自上海生工生物技术有限公司，WD-9403B型紫外透射反射仪、ECP-3000电泳仪购自北京六一仪器厂，流式细胞仪购自美国Calibur公司，UVP图像处理仪购自美国Gene公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞传代 HL-60细胞在RPMI1640培养基（含15%胎牛血清，2g.L碳酸氢钠，300mg.L葡萄糖，青霉素、链霉素各200U.L）中传代培养，每3～4天传代1次。培养条件:5%CO2 ，饱和湿度，37℃。
1.2.2 第1部分―――HL-60细胞凋亡 指数生长期HL-60细胞1×10 6 .L，置于96孔培养板内，每孔各1ml，分别培养2h后，分为2组。A组加PBS液0.1ml;B组又分为3组，各组分别加入终浓度为1、10、100μmol.L的THP各0.1ml，各组继续培养12h后待测细胞凋亡率。
1.2.3 第2部分―――HL-60细胞NF-κB p65活化 指数生长期HL-60细胞1×10 6 .L，置于96孔培养板内，每孔各1ml，分别培养2h后，分为2组。A组加PBS液0.1ml;B组又分为3组，各组分别加入终浓度为1、10、100μmol.L的THP各0.1ml，各组继续培养3h后待测NF-κB p65活化率。
1.2.4 DNA梯状凝胶电泳法检测细胞凋亡率 分别取第1部分各组样本200μl加入400μl细胞裂解液，按照DAN电泳试剂盒说明书提取DNA。每孔取样8μl，混以含溴酚蓝的样品缓冲液，同时用Pharm-cia100bp的Marker，加入1.8%琼脂糖灌注的凝胶加样孔中，电压85V，30min，WD-9403B型紫外透射反射仪，以UVP图像处理系统成像。
1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 分别取第1部分各组样本1ml，1000r.min离心5min，PBS洗涤1次，400目筛网过滤2次;70%冷乙醇固定，4℃冰箱过夜;PBS洗去固定液，复洗2次，重悬于500ml PBS中;加核糖核酸酶（RNase，终浓度100mg.L），37℃水浴30min;加PI染液（终浓度50mg.L），4℃避光30min，流式细胞仪检测。
1.2.6 流式细胞仪检测NF-κB p65活性 分别取第2部分各组样本1ml，1500r.min离心10min，弃 上清;PBS洗涤2次;加1∶50稀释的NF-κB p65一抗（兔抗人单抗）100μl，室温孵育30min，PBS洗涤2次;加1∶50稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗（鼠抗兔单抗），室温避光孵育30min，PBS洗涤2次;1%副醛固定细胞，流式细胞仪检测;每组实验均设阴性对照，该对照只加二抗，不加一抗，余处理同实验组。以上所有实验重复做3遍。
1.3 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件处理数据，实验数据用ˉx±s表示。实验数据首先进行方差齐性检验和两两比较SNK法检验，两独立样本均数采用t检验，THP诱导的HL-60细胞NF-κB p65活化率采用Kruskal-Wallis秩和检验，检验水准:α=0.05。
2 结 果
2.1 THP诱导HL-60细胞凋亡
2.1.1 流式细胞检测技术（FCM） 3种THP浓度诱导HL-60细胞凋亡率组间两两及与对照组比较差异有统计学意义（P&<0.05），组间方差齐性检验F=679.19。见表1。 表1 不同剂量THP诱导HL-60细胞的凋亡率的比较与A组比较:*P&<0.05;THP组两两比较:P均&<0.05 2.1.2 DNA梯状凝胶电泳法 Ladder出现从多到少的顺序为:100μmol.L THP、10μmol.L THP、1μmol.L THP、对照组。见图1。 3 讨 论
3.1 THP对HL-60细胞凋亡的影响 凋亡又称程序性死亡，受多基因调控，多种细胞因子参与。凋亡细胞在细胞形态学、生化学上均发生了特征性的变化，包括DNA片段化（fragmentation）、染色质浓缩、包膜泡化（blebbing）、细胞皱缩、凋亡小体形成、细胞内Ca 2+ 浓度快速持续升高、相关酶的变化（如内源性核酸内切酶和转谷氨酰胺酶等）、表面结构的变化等，最终导致细胞裂解，其与细胞坏死有本质区别。诱导白血病细胞凋亡是化疗药物治疗白血病的主要机制。化疗药物诱导白血病细胞凋亡的机制可能在于:①Fas-FasL途径。引发一组caspase的级联反应，使细胞凋亡 ［1］ 。②激活Bcl基因家族中Bax。Bcl基因家族中Bcl-2及Bcl-xL主要抑制细胞凋亡，而Bax则促进凋亡［2］ 。③通过野生型p53基因（wtp53）而诱导细胞凋亡［3］ 。我们的实验结果表明，THP均能促进HL-60细胞凋亡，并存在剂量依赖性。 3.2 THP对HL-60细胞NF-κB p65活性的影响 NF-κB是一种多效性的转录因子，生物学功能十分广泛。NF-κB家族由NF-κB.Rel蛋白家族中的成员以同源或异源二聚体形式存在。到目前为止，在哺乳动物细胞中已发现5种NF-κB家族成员:RelA（p65）、RelB、c-Rel、NF-κB1（p50）和NF-κB2（p52）。其中p50.RelA（又称p50.p65）是发现最早、分布最广泛的，所以一般意义上，NF-κB常常是指p50.RelA二聚体。1996年，国外报道NF-κB是肿瘤坏死因子（TNF）和化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡耐受的重要因子［4］ ，这引起了众多医务工作者的关注。
通常情况下，NF-κB和其抑制因子IκB以非活性形 式存在于各型细胞的细胞质中，只有被激活后，才从细胞质转位进入细胞核发挥作用。此后的一些研究表明，某些抗癌药物在诱导肿瘤细胞凋亡的过程中，可同时活化其NF-κB ［5～7］ 。Arlt等 ［8］ 在大鼠实体瘤依赖NF-κB的化疗药物耐药时发现，持续活化的NF-κB明显地维持肿瘤的存活，降低化疗药物对肿瘤细胞的敏感性，而这些化疗药物自身又能诱导NF-κB活化，从而降低自身对肿瘤的敏感性。我们的研究结果显示，THP有诱导HL-60细胞NF-κB p65活化的作用，并存在剂量依赖性。目前认为，化疗药物增强NF-κB活性的机制可能有以下几条途径。①通过拓扑异构酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ，TopoⅡ）途径:Boland等9］ 发现，在TopoⅡ存在的情况下，蒽环类化疗药物能诱导HL-60细胞NF-κB的活化。TopoⅡ抑制剂ICRF187能阻止蒽类化疗药物作用后HL-60细胞INF-κB的降解，使NF-κB和INF-κB结合成复合体，使NF-κB失去活性。②caspase途径:Hu等［10］ 认为caspase-8与NF-κB关系密切，前者介导了后者的激活，而且，caspase-8对NF-κB的激活与启动凋亡是分离的，可能通过IKK途径实现。反之，NF-κB也能阻断caspase-8的激活，发挥诱导凋亡的抑制作用。
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