【摘要】 目的 研究木蹄层孔菌乙醇提取物（EEF）的体内抗肿瘤活性及其对荷瘤鼠免疫功能的影响。方法 建立ICR鼠S180肉瘤模型，EEF 3个剂量组灌胃给药，10天后计算抑瘤率、脾指数、胸腺指数及EEF对荷瘤鼠淋巴细胞转化能力、脾细胞抗体生成能力和NK细胞活性的影响。结果 100、250、500 mg·kg-1·d-1 3个剂量组的抑瘤率分别为38.5%、41.6%、59.5%，均能提高荷瘤鼠的脾指数，增强荷瘤鼠的淋巴细胞转化能力，脾细胞抗体生成能力，NK细胞活性。结论 EEF有明显的体内抗肿瘤活性。
【关键词】 木蹄层孔菌；抗肿瘤活性；免疫功能
Abstract: Objective To study the anti-tumor effect of ethanol extract of Fomes fomentarius (EEF) in vivo and its influence on immunological function. Methods ICR mice carrying S180 sarcoma were given three different doses of EEF. Ten days later， the tumor-inhibitory rate， spleen index， thymus index， the ability of splenic lymphocyte transformation， the formation of antibody in splenic cells and the activity of NK cells were observed. Results The inhibitory rates in the groups treated with EEF 100， 250 and 500 mg·kg-1·d-1 were 38.5%， 41.6% and 59.5%， respectively. The medicine could also obviously enhance the spleen index， promote the splenic lymphocyte transformation， the antibody formation in splenic cells and the activity of NK cells. Conclusion Extract of Fomes fomentarius has obvious anti-tumor ability in vivo.
Key words: Fomes fomentarius; anti-tumor activity; immunological function
木蹄层孔菌（Fomes fomentarius）是多孔菌科的一种大型药用真菌。子实体马蹄型，为民间抗癌药物，味微苦，性平，消积化瘀。子实体水煎服，可用于治疗食管癌、胃癌、子宫癌、小儿积食［1］ 。对该药的药理活性过去仅限于对其水提物的报道，尚未见深入研究的报道。本实验用木蹄层孔菌乙醇提取物（ethanol extract of Fomes fomentarius，EEF）作用于体内的肿瘤细胞，旨在探讨EEF的体内抑瘤活性及其对荷瘤鼠免疫功能的影响。中草药的天然产物中存在着广泛的生物活性物质，如何从中草药中寻找毒副作用小，作用独特的抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物［2］，发挥我国传统中药的优势将为肿瘤的治疗另辟蹊径，木蹄层孔菌作为传统的民间抗癌药物在肿瘤治疗方面有广阔的前景，值得深入研究。本实验旨在为这一传统药物的开发提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 药品和试剂 木蹄层孔菌（购自大连王力商行）碾碎用无水乙醇煮沸浸提2～3次，过200目滤网，所得浸膏冷冻干燥，得棕色粉末。临用前将粉末先溶于少量乙醇，再加吐温-80助溶，后用蒸馏水稀释到所需浓度；用于体外实验药物用1% DMSO+完全RPMI-1640培养基稀释。
新生小牛血清购自美国Hyclone公司，胰蛋白酶购自上海华美公司，噻唑兰（MTT）、二甲基亚枫（DMSO）、 DNaseⅠ、 RNase、刀豆蛋白A(ConA)为Sigma公司产品，环磷酰胺（江苏连云港恒瑞制药厂）。
1.1.2 实验动物及肿瘤细胞株 清洁级ICR鼠，雌雄各半，18～22 g；S180腹腔积液瘤种鼠（购自中国医学科学院协和医科大学药物研究所），Hela细胞株购自军事医学科学院病毒研究所。
1.1.3 主要设备 CO2培养箱（SHELBA）、酶联免疫检测仪（Bio-RAD公司）、离心机（上海飞鸽离心机厂）、分析天平（Sartorius）、722可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，FACS Calibur型流式细胞仪（Becton Dickinson）。
1.2 实验方法
1.2.1 体内抗肿瘤实验及对免疫器官的影响 参照文献［3］，无菌抽取接种7～8天的S180荷瘤鼠腹腔积液，用灭菌生理盐水稀释成1.0×107个/ml肿瘤细胞悬液，以每鼠0.2 ml接种于健康ICR鼠右后肢皮下腹沟处，24 h后随机分为EEF大剂量组（500 mg·kg-1·d-1）、中剂量组（250 mg·kg-1·d-1 ）、小剂量组（100 mg·kg-1·d-1 ）、环磷酰胺阳性对照组（30 mg·kg-1·d-1 ）、模型组及正常对照组，每组10只。于每日同一时间灌胃给药，连续10天，末次给药后24 h，摘眼球放血处死小鼠，剥离瘤块，摘取脾脏、胸腺，电子天平称重，计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数。肿瘤生长抑制率=(1-实验组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100%［4］。
1.2.2 荷瘤鼠淋巴细胞转化实验 参照文献［5］，ICR鼠接种、分组和给药同1.2.1，末次给药后24 h，无菌取出脾脏，制成5.0×106/ml脾细胞悬液，每孔1 ml于24孔板中，分2孔，一孔加ConA（终浓度5 μg/ml），另一孔不加。置于5%CO2、37℃培养72 h，结束培养前4 h每孔轻轻吸取上清液0.7 ml，补加0.7 ml不含FCS的RMPI-1640，同时加5 g/L MTT 50 μl，继续培养4 h，取出培养孔，每孔加入1 ml酸性异丙醇，吹打均匀，静置20 min，使紫色结晶完全溶解，溶解液移入离心管，1500 r/min离心5 min，取上清200 ml于96孔酶标板中，570 nm比色测光密度（D）值。淋巴细胞的增殖能力用加ConA的光密度减去不加ConA的光密度表示。
1.2.3 荷瘤鼠脾细胞抗体生成实验 ICR鼠接种，分组，给药同1.2.1，灌胃5天后腹腔注射0.2 ml 20%绵羊红细胞（约2×109/ml），5天后无菌取脾脏，用PBS配成3.5×106/ml脾细胞悬液，于干净试管中依次加入1×107/ml绵羊红细胞、1∶10稀释的豚鼠血清、脾细胞悬液各1 ml，37℃水浴1 h，2000 r/min离心5 min，取上清于413 nm处测定光密度值［5］。
1.2.4 荷瘤鼠NK细胞活性实验 ICR鼠接种，分组，给药同1.2.1，末次给药后24 h，无菌取脾脏，制成脾细胞悬液，用Hela细胞作为靶细胞，用RPMI 1640完全培养基分别将效应细胞、靶细胞调至1.0×107/ml、2.0×105/ml。加入96孔板中，使效应细胞∶靶细胞=50∶1，另设效应细胞和靶细胞对照。每孔100 μl，每份标本设3个平行孔。置于37℃，5%CO2条件下杀伤4 h，加入MTT(5 g/L)15 μl，继续孵育3 h，每孔加100 μl酸化异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解。于酶标仪570 nm处测光密度。NK细胞活性按下式公式计算：NK细胞活性百分比=［靶细胞D值-（实验组D值-效应细胞D值）］/靶细胞D值 ×100%［6］。
2 结 果
2.1 EEF的抑瘤作用及对荷瘤小鼠免疫器官的影响 EEF在100～500 mg·kg-1·d-1 范围内均有一定的抑瘤效应，且500 mg·kg-1·d-1 剂量组的抑瘤率达59.5%，超过经典的抗癌药物环磷酰胺。与环磷酰胺在抑制肿瘤生长的同时降低荷瘤鼠的脾系数和胸腺系数不同，该药能明显增加荷瘤鼠的脾系数和胸腺系数（表1）。
2.2 EEF对荷瘤鼠淋巴细胞转化能力及对脾细胞抗体生成能力的影响 与模型组相比，EEF中、大剂量均能明显提高荷瘤鼠脾细胞抗体生成能力(P&<0.01，P&<0.05)，与荷瘤对照组相比差异显著；3个剂量组均能明显提高荷瘤鼠的淋巴细胞转化能力，影响极显著(P&<0.01)；而环磷酰胺组对脾细胞抗体生成能力和淋巴细胞转化无显著影响（表2）。表1 EEF的抑瘤活性及对胸腺指数和脾指数的影响表2 EEF对淋巴细胞转化、脾细胞抗体生成能力的影响
2.3 EEF对荷瘤鼠NK细胞活性的影响 与模型组相比，3个剂量组均能提高给药鼠的NK细胞活性，差异达极显著水平(P&<0.01)，而环磷酰胺对荷瘤鼠NK细胞活性的影响无统计学意义（表3）。表3 EEF对NK细胞活性的影响
3 讨 论
中药增强机体免疫功能是其抗肿瘤的主要机制之一［7］。现代免疫学认为，人体的免疫系统具有免疫监视功能，能监督机体内环境出现的突变细胞及早期肿瘤，并予以清除。因此，肿瘤与机体免疫系统的状态密切相关［8］。本实验采用木蹄层孔菌灌胃给药进行体内抗肿瘤试验，结果显示EEF在100～500 mg·kg-1·d-1 剂量下均能明显抑制肿瘤生长，其中500 mg·kg-1·d-1 给药组的抑瘤率超过了经典的抗癌药物环磷酰胺，且3个剂量组均能明显提高荷瘤鼠的胸腺系数和脾脏系数。免疫学实验结果显示EEF能全面增强荷瘤鼠的非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫功能，提示EEF可能是通过增强宿主免疫功能起抑制肿瘤生长的。与传统的化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时又不同程度的损伤机体的免疫功能相比，是较为理想的。
木蹄层孔菌乙醇提取物为一复杂的混合物，其体内抗肿瘤活性是多种组分的综合作用还是某一种或几种组分的作用，还有待于对其成分进行分析，开展进一步的研究。
【参考文献】
［1］ 卯晓岚，蒋长坪，欧珠次旺主编.西藏大型经济真菌［M］.北京：北京科学技术出版社，1993.464.
［2］ 王三龙，蔡 兵，崔承彬，等.中草药及其活性成分抗肿瘤的研究进展［J］.中草药，2003，9（9）：12-15.
［3］ 于 红，张学成. 螺旋藻多糖对小鼠S-180肉瘤的免疫抑制作用［J］.海洋科学，2003，27（5）：58-60.
［4］ 周 俊，殷学军，王 瑞，等.蛇床子水提取液对小鼠S180肉瘤的抑制作用［J］.癌变·畸变·突变，2001，13（3）：160-163.
［5］ 林清华主编.免疫学实验［M］.武汉：武汉大学出版社，1999.192-193，226.
［6］ 叶 萍，李 燕，谷淑燕.MTS和MTT法检测小鼠NK及特异性细胞毒性T细胞活性的比较［J］.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12（1）：85-86.
［7］ 张 孜，张瑾峰.中药抗肿瘤作用机制研究进展［J］.中国现代实用医学杂志，2006，5（2）：28-32.
［8］ 赵 峰，刘培勋.中药抗肿瘤及其转移机制研究进展［J］.中国中西医结合杂志，2007，27（2）：178-181.