【关键词】 壳寡糖;S180肉瘤;细胞周期;凋亡;小鼠
摘要 :目的 探讨壳寡糖对S180肉瘤细胞的生物学效应，为其治疗肿瘤提供新的理论基础。 方法 体外实验:用流式细胞仪测壳寡糖作用下S180肉瘤细胞周期、细胞凋亡情况。体内实验:建立S180肉瘤小鼠皮下移植瘤模型，给予壳寡糖后，测瘤体积，并用免疫组化法测瘤组织Bax、Bcl-2蛋白的表达情况。 结果 体外实验:高浓度壳寡糖作用后S180肉瘤细胞阻滞于G 0 .G 1 期，同时S180肉瘤细胞凋亡增加。体内实验:壳寡糖对小鼠S180肉瘤有明显的抑制作用并能提高促凋亡基因Bax的表达，降低抑凋亡基因Bcl-2的表达。 结论 壳寡糖可抑制S180肉瘤细胞的生长，使S180细胞阻滞于G0 .G 1 期并诱导其发生凋亡，其机制可能与Bcl-2蛋白下调而Bax蛋白上调有关。
关键词 :壳寡糖;S180肉瘤;细胞周期;凋亡;小鼠
Abstract:Objective To investigate the biological effect of chito-oligosaccharide on Sarcoma180（S180）cells to assess the possibility and potential value of chito-oligosaccharide in tumor therapy.Methods In the experiment in vitro，suspended S180cells were treated with chito-oligosaccharide.Flow cytometry was used to study the changes in tumor cell apoptosis and cell cycle consequential to the treatment.For experiment in vivo，Kunming mice bearing S180in groups were given varied doses of chito-oligosaccharide for7days.The mice were then killed to determine the tumor volume and to determine the expression of apoptosis-related proteins（Bcl-2and Bax）by immunohistochemistry.Results Experiment in vitro showed relatively high concentration of chito-oligosacharride arrested the growth of S180cells at G 0 .G1 phase and increased the apoptotic rate of tumor cells.Experiment in vivo showed the growth of S180cells was inhibited by chito-oligosaccharide（in a concentration-depen-dent manner）.The expression of antiapoptotic protein Bcl-2was decreased and the expression of proapoptotic protein Bax was increased.Conclusion Chito-oligosaccharide can inhibit the growth of S180cells，arresting them at G0 .G 1 -phase and stim-ulating an increase of their apoptosis，possibly through downregulation of Bcl-2and upregulation of Bax.
Key words:chito-oligosaccharide;sarcoma180cell;cell cycle;apoptosis;mice
肿瘤是危害人类健康最重要的疾病之一。目前大部分抗肿瘤药物虽对肿瘤细胞有一定的抑制和杀伤作用，但往往也影响正常细胞的代谢，从而影响了疗效，并使肿瘤患者更为衰弱甚至造成患者死亡。因此，寻找低毒、安全、高效的抗肿瘤药物历来是国际上的重点研究课题。海洋多糖甲壳素（主要从虾、蟹壳中提取）作为生物合成的天然高分子物质，它具 有可生物降解、安全无毒、有良好的生物兼容性且化学性质稳定等许多独特的优点。甲壳素脱乙酰基后衍生为壳聚糖，壳聚糖再降解后的产物为壳寡糖。目前国内外对于壳聚糖有较广泛的研究，大量的研究还发现壳聚糖及其衍生物可以通过激活机体免疫系统而抑制肿瘤的生长 ［1］ 。但是壳聚糖很难溶于水，给广泛应用带来一定困难。壳寡糖的许多性质与壳聚糖相似，具有低毒、易溶解、易吸收、使用方便等优点。目前，国内外对于壳寡糖的抗肿瘤作用机制的研究刚刚起步，而且大多集中在壳寡糖通过增强宿主免疫功能而发挥抗肿瘤作用方面［2］ 。如果对其抗肿瘤作用进行深入研究，进而阐明其机制，有可能使壳寡糖作为抗肿瘤药或辅助药在临床得以广泛应用，造福于人类。
1 材料和方法
1.1 实验材料 水溶性壳寡糖（3～7个氨基葡萄糖结合体）由徐州医学院生物化学教研室任孝衡老师馈赠;顺铂为江苏豪森药业股份有限公司产品;RPMI1640粉剂为GIBCO公司产品;PI染液、RNA酶均为Sigma公司产品;小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;淋巴细胞分离液、免疫组化试剂Bcl-2（sc-492）（N-19），Bax（sc-526）（P-19）抗体均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。 1.2 实验动物 S180腹水瘤荷瘤小鼠购自上海细胞生物学研究所;昆明小鼠由徐州医学院实验动物中心提供。
1.3 实验方法
1.3.1 分离提取肿瘤细胞 用淋巴细胞分离液分离提取肿瘤细胞，台盼蓝染色证实肿瘤细胞存活率大于99%。
1.3.2 体外实验
1.3.2.1 实验分组 配制肿瘤细胞悬液，浓度为1×10 8 个.L，使培养液中壳寡糖终浓度为0（阴性对照组）、100、200、400mg.L，顺铂10mg.L（阳性对照组）。将各组置37℃、5%CO 2 恒温培养箱培养7天，第4天半量换液1次。
1.3.2.2 壳寡糖对肿瘤细胞生长的影响 每天取不同浓度组平行样本5个，台盼蓝染色，细胞计数法检测壳寡糖作用于S180肉瘤细胞后对细胞生长的影响。
1.3.2.3 流式细胞仪测细胞凋亡、增殖和细胞周期 于培养96h取细胞70%乙醇（4℃预冷）4℃冰箱固定20～30min后碘化丙啶染液染色20min，置流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡情况。按公式计算:增殖指数=（S+G2 .M）.（G 0 .G 1 +S+G2 .M）
1.3.3 体内实验
1.3.3.1 实体瘤生长抑制实验 用生理盐水配备小鼠瘤细胞悬液，浓度为2×1010 个.L。选体重18～22g昆明小鼠60只，雌雄各半。于小鼠左下腹股沟皮下注射瘤细胞悬液每只0.2ml（内含瘤细胞4×10 6 个）。将小鼠分为5组，每组12只，雌雄各半。分别为阴性对照组（腹腔给予生理盐水）、阳性对照组（腹腔给予顺铂:4mg・kg-1 ・d-1 ）及3个实验组（腹腔给予不同浓度的壳寡糖:50、100、200mg・kg-1 ・d -1 ）。于接种肿瘤细胞96h起给药，每天1次，连续7天，停药2天处死小鼠，取肿瘤，测肿瘤体积。按公式计算抑瘤率。抑瘤率=（对照组瘤体积-试验组瘤体积）.对照组瘤体积×100%
1.3.3.2 免疫组化染色 免疫组化染色（Power Vi-sionTM 两步法）检测瘤组织Bcl-2和Bax蛋白的表达。染色结果判定:光镜高倍镜下观察，随机选择10个视野，计算1000个细胞的阳性细胞数。
1.4 统计学处理 数据以ˉx±s表示，采用SPSS11.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差法（LSD法）。
2 结 果
2.1 细胞计数法检测壳寡糖作用于S180肉瘤细胞后对细胞生长的影响 见表1。在体外，S180肉瘤细胞与不同浓度壳寡糖共同培养的第4天，400mg.L组开始出现肿瘤细胞生长的抑制，随着培养时间的延长，200mg.L组对细胞生长的抑制作用也趋明显。至培养的第7天，200mg.L、400mg.L与100mg.L组之间的差异亦具有统计学意义。 表1 S180肉瘤细胞与不同浓度壳寡糖共同培养后不同时间细胞计数与阴性对照组比较:△P&<0.05;与100mg.L组比较:*P&<0.05
2.2 壳寡糖对S180细胞凋亡及增殖周期的影响 见表2。S180肉瘤细胞与不同浓度壳寡糖共同培养96h，各组肿瘤细胞中处于G 2 .M期的细胞比例之间的差异无统计学意义。400mg.L壳寡糖组中处于 G 0 .G1 期的细胞比例升高，处于S期的细胞比例下降，与阴性对照组中处于G 0 .G1 期的细胞比例和处于S期的细胞比例之间的差异分别具有统计学意义。400mg.L壳寡糖组S180肉瘤细胞增殖指数下降。 表2 壳寡糖对S180细胞凋亡及增殖周期的影响
2.4 壳寡糖注射后小鼠S180肉瘤肿瘤组织Bax及Bcl-2蛋白表达情况 见表4。经壳寡糖作用后S180肉瘤细胞中Bcl-2蛋白表达减少，200mg・kg -1 ・d -1 组壳寡糖作用后表达明显降低;阴性对照组S180肉瘤细胞小鼠皮下移植瘤组织低表 表4 壳寡糖对S180肉瘤Bax和Bcl-2蛋白表达
3 讨 论
细胞周期是指正常连续分裂的细胞从前一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的连续的动态过程。细胞周期按顺序分为:G 0 期（静止期），G1 期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G 2 期（DNA合成后期）和M期（有丝分裂期）。无限制的快速增殖是恶性肿瘤的特征之一，肿瘤的生长速度取决于肿瘤组织中增殖细胞的多少及其分裂速度。研究肿瘤增殖是人们了解和控制肿瘤的一条途径。肿瘤细胞增殖的速度主要决定于G 0 .G 1 期的长短及参与分裂的细胞数量的多少。本研究中体外实验发现壳寡糖能使S180肉瘤细胞阻滞在G 0 .G1 期，使其进入S期的细胞数减少，从而抑制肿瘤细胞的生长增殖，且具有剂量依赖性，说明壳寡糖可以不通过免疫系统抑制肿瘤的生长。以上结果说明，细胞周期阻滞可能是壳寡糖抑制肿瘤细胞生长的作用机制之一。壳寡糖具体通过什么机制引起肿瘤细胞周期阻滞还需要进一步的研究。
凋亡是细胞在基因调控下的一种主动性死亡。细胞的增殖、分化和凋亡相互协调，维持着正常组织的生长平衡。大多数抗癌药物都可引起肿瘤细胞的凋亡;诱导细胞凋亡可能是不同机制的抗癌药物发挥作用的共同通路。细胞凋亡过程受凋亡相关基因的调控，其中Bcl-2基因家族备受关注。Bcl-2基因家族包括很多成员，按其对凋亡正、负调控作用可分为两类:一类为凋亡促进基因，如Bax、Bcl-xs、Bad等;另一类为凋亡抑制基因，如Bcl-2和Bcl-x2、Bcl-xl等。Bax能与Bcl-2形成异二聚体复合物从而取消Bcl-2基因的抗凋亡作用［3］ 。两类基因或形成同二聚体或形成异二聚体，相互作用通过不同的机制，正负调控细胞的凋亡，从而影响肿瘤细胞对凋亡的抗性。本实验发现，200mg・kg-1 ・d-1 壳寡糖可以下调S180肉瘤细胞的Bcl-2表达，而对S180肉瘤细胞Bax的表达有上调作用。Bcl-2蛋白家族可能是各种凋亡信号的会聚点 ［4］ ，Bcl-2、Bax二者的比例关系对细胞凋亡起重要作用［5］ 。体内实验结果显示壳寡糖对小鼠S180肉瘤细胞皮下移植瘤有抑制作用，200mg・kg -1 ・d -1 壳寡糖对小鼠S180肉瘤细胞皮下移植瘤的抑制作用和顺铂组相当。注射壳寡糖后S180肉瘤组织Bcl-2和Bax免疫组化染色显示，阴性对照组S180肉瘤细胞小鼠皮下移植瘤组织高表达Bcl-2蛋白（77.64±13.67）%。而经壳寡糖作用后，S180肉瘤组织中Bcl-2蛋白表达减少，而Bax蛋白表达增加，Bax.Bcl-2比例升高。由此可认为，在壳寡糖诱导S180肉瘤细胞凋亡的过程中，Bax.Bcl-2起了重要作用，壳寡糖可能通过Bax.Bcl-2通路诱导S180肉瘤细胞凋亡。
参考文献
:［1］ Maeda Y，Kimura Y.Antitumor effects of various low-molecular-weight chitosans are due to increased natural killer activity of intestinal intraepithelial lymphocytes in sarcoma180-bearing mice［J］.J Nutr，2004，134（4）:945-950.
［2］ Feng J，Zhao L，Yu Q.Receptor-mediated stimulatory effect of oli-gochitosan in macrophages［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，317（2）:414-420.
［3］ Beerheide W，Tan YJ，Teng E，et al.Downregulation of proapoptotic proteins Bax and Bcl-X（S）in p53overexpressing hepatocellular car-cinomas［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，273（1）:54-61.
［4］ Tsujimoto Y，Shimizu S.Bcl-2family:life-or-death switch［J］. FEBS Lett，2000，466（1）:6-10.
［5］ 曾小莉，涂植光.细胞凋亡基因调控机制研究进展［J］.国外医 学・临床生物化学与检验学分册，1999，20（2）:80-82.