作者：徐志伟 徐夏红 董红燕 张中明
【关键词】 心肌梗死;单核细胞;Nkx2-5
摘要 :目的 观察小鼠心肌梗死后，骨髓及外周血单核细胞心肌特异性转录因子Nkx2-5的变化。 方法 用大剂量异丙肾上腺素（10mg.kg）连续注射3天造成小鼠心肌急性缺血性梗死模型，第3天注射后30min，通过眼球摘除法取外周血，分离双后肢股骨、胫骨，冲洗骨髓腔得骨髓液，经密度梯度离心分离出骨髓及外周血单核细胞，正常组同心肌缺血梗死组。通过细胞Western blotting分析，比较正常组和心肌梗死组骨髓及外周血单核细胞中心肌特异性转录因子Nkx2-5的变化。 结果 正常骨髓单核细胞中存在Nkx2-5的表达，正常外周血单核细胞中Nkx2-5无表达;心肌梗死后骨髓及外周血Nkx2-5表达均明显增加，同正常组比较有统计学意义，P&<0.05。 结论 正常骨髓中无需培养或诱导即存在表达Nkx2-5的单核细胞，在心肌急性梗死后向外周血动员增加。
关键词 :心肌梗死;单核细胞;Nkx2-5
Abstract:Objective To examine the cardiac specific transcription factor Nkx2-5in the bone marrow and peripheral blood after myocardial infarction.Methods The mouse model of myocardial infarction was formed by sequential injection of large dose Iso（10mg.kg）for3days.Bone marrow and peripheral blood mononuclear cells（PBMC）were then collected from the model and the normal control mice to compare the expression of Nkx2-5in bone marrow and PBMC through Western blot-ting.Results Nkx2-5was found to be positive in normal bone marrow，but weak or negative in normal PBMC.The Nkx2-5expression became positive and obviously increased in both bone marrow and PBMC after myocardial infarction（P&<0.05）.Conclusion The mononuclear cells，which express Nkx2-5，reside in bone marrow and are mobilized into peripheral blood after myocardial infarction，participating in repairing the infarction zone.
Key words:myocardial infarction;mononuclear cells;Nkx2-5
转录因子Nkx2-5是NK型同源盒基因家族Nkx2型的成员，是心脏祖（前体）细胞（cardiac pro-genitor cell，CPC）分化的最早期标志之一，具有显著性的心脏特异性表达的特点［1］ 。而CPC也被认为主要存在与心脏本身某些部位［2-3］ 。但近年有文献在核酸水平证实，在骨髓单核细胞群中存在CPC，无须培养或诱导即表达Nkx2-5，通过离体趋化性实验发现该群细胞可以向梗死心肌趋化［4］ 。本研究在异丙肾上腺素致小鼠心肌急性缺血梗死模型基础上，进一步在蛋白水平证实在骨髓单核细胞群中有Nkx2-5的表达，心肌梗死后外周血及骨髓Nkx2-5表达均明显上调。
1 材料和方法
1.1 动物 昆明种小鼠，雌雄不拘，体重（20±2）g，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 试剂 羊抗Nkx2-5多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，碱性磷酸酶标记兔抗羊IgG购自北京中杉金桥生物公司，NBT.BCIP购自美国Sigma公司，盐酸异丙肾上腺素购自山东科峰制药有限公司，小鼠单核细胞分离液购自上海奇康生物科技有限公司，改良Western细胞裂解液购自上海西唐生物公司。
1.3 小鼠心肌梗死模型的制作 8只小鼠随机分为正常组和心肌梗死组，每组4只。心肌梗死组小鼠每只每天腹腔注射异丙肾上腺素10mg.kg，连续注射3天。正常组小鼠给予生理盐水代替异丙肾上腺素。第1天注射前8只小鼠均记录正常心电图，第3天注射完30min后再次记录心电图，观察是否造成心肌缺血梗死。
1.4 Western blotting测定Nkx2-5蛋白的表达
1.4.1 外周血单核细胞的获得 记录完心电图后，正常组和心肌梗死组随机各取2只小鼠通过摘除眼球法获取外周血，每只小鼠约可获得0.8～1.0ml的外周血。加入1∶200稀释肝素抗凝后用生理盐水等倍稀释，将稀释外周血缓慢叠加于比重为
1.090±0.001的单核细胞分离液面上，水平离心 2000r.min×20min。离心后管内分为3层，上层为血浆层，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为单核细胞分离液，在上、中层界面处有一白色云雾层狭窄带，即为单核细胞层。用毛细血管插到云雾层，吸取单核细胞悬液至另一EP管中。
1.4.2 骨髓单核细胞的获得 正常组和心肌梗死组各取2只小鼠颈椎脱臼法处死，剥离双后肢股骨、胫骨，剪去两端后用PBS冲洗骨髓腔得骨髓液，余步骤同1.4.1。
1.4.3 Western blotting测定目的蛋白 离心收集骨髓及外周血单核细胞，弃上清后在EP管中加入200μl细胞裂解液，用手指轻弹使细胞沉淀与裂解液充分接触，置于冰浴中，至肉眼观无明显细胞沉淀为裂解完全，12000g离心5min去除细胞碎片，Lowry法（Folin-酚法）测定蛋白质含量，取50μg总蛋白样品在10%SDS-PAGE进行电泳分离，经电转膜仪转至硝酸纤维素膜。然后用5%脱脂奶粉室温封闭5h，弃溶液，加入用5%脱脂奶粉稀释的羊抗小鼠Nkx2-5抗体（1:200稀释），室温轻摇过夜，TBST洗膜3次，加入用5%脱脂奶粉稀释的碱性磷酸酶标记的兔抗羊IgG（1∶500稀释），室温轻摇2h，TBST洗膜3次后，加入NBT.BCIP显色，待蛋白带的颜色深度达到要求后，停止显色，ImageJ软件分析条带灰度。
1.5 病理组织学观察 心肌梗死组心脏立即放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，作冠状断面切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察心肌组织的损伤情况。
1.6 统计学处理 SPSS10.0软件分析正常组与心肌梗死组之间差异，采用t检验作组间统计学处理，P&<0.05有统计学意义。
2 结 果
2.1 心肌梗死模型的制作 见图1、2，可见心肌梗死组心电图与正常组相比，电压明显降低，ST段抬高;而图3的病理组织学观察显示异丙肾上腺素所致心肌损伤均较为严重，心肌纤维肿胀，断裂，发生挛缩，可见明显的坏死灶。
2.2 骨髓及外周血Nkx2-5表达的变化 见图4，Western blotting结果显示心肌梗死组外周血中Nkx2-5表达与正常对照组外周血相比明显增强，差异有统计学意义（P&<0.05）。而正常对照组骨髓中即有Nkx2-5的表达，心肌梗死组骨髓中Nkx2-5表达与正常对照组相比也明显增强，差异有统计学意义（P&<0.05）。见表1。
3 讨 论
细胞心肌成形术（cellular cardiomyoplasty，CCM）是一种将体外培养的干细胞或其他肌源性细胞移植到受损心肌中，令其分裂、增殖，以替代梗死心肌，达到改善心脏功能的生物技术，作为心肌梗死的一种有效治疗手段，目前已经成为临床研究的热点。其中移植细胞类型的选择众说纷纭，已展开研究的包括心肌细胞、胚胎干细胞、骨骼肌卫星细胞、平滑肌细胞和骨髓单核细胞5～7］ ，以上细胞因与心肌细胞正常生理结构存在差异，亦存在其局限性，应用于临床的也只有骨髓单核细胞。但是骨髓单核细胞是一群混杂的干细胞群，其应用的缺陷主要在于混杂干细胞群是否会出现横向分化，如何避免分化为新的不需要的细胞类型。
随着骨髓干细胞移植在临床的广泛应用，用于移植的细胞也从原来的混合细胞群逐渐向某亚细胞群过渡。目前骨髓中CPC亚群的发现，为临床的应用提供了新的选择。至于证实此类细胞亚群存在的形态学证据，向心肌细胞方向分化的效率，由骨髓向外周血动员的机制还有待于进一步的研究。
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