作者：马巧英 徐铁军 王鹤鸣 王梅申
【关键词】 RNA结合蛋白;Musashi1;神经干细胞;脑室下区;大鼠
摘要 :目的 观察神经特异性RNA结合蛋白Musashi1（Msi1）在大鼠生后不同发育时间侧脑室脑室下区（SVZ）内的表达变化。 方法 健康雄性SD大鼠，分为7天、2周、3周、1月、2月、成年（6月龄）和老年（18月龄）7组，每组5只，共35只，多聚甲醛灌注固定，冰冻冠状切片，免疫组织化学（ABC法）染色，光镜观察摄像，细胞计数。 结果 各年龄组大鼠侧脑室周围的SVZ内可见Msi1免疫反应阳性细胞，胞体小圆形，无突起或1～2个短突起，分布疏密不均匀;随年龄增长，SVZ内Msi1阳性细胞逐渐减少，老年组大鼠仍然有一定数量的Msi1阳性细胞。 结论 大鼠侧脑室SVZ内存在有Msi1阳性细胞，并随年龄增长而明显减少，这些细胞可能是神经干细胞。
关键词 :RNA结合蛋白;Musashi1;神经干细胞;脑室下区;大鼠
Abstract:Objective To observe the expression of neural RNA-binding proteins Musashi1（Msi1）in the subventricular zone（SVZ）of lateral ventricles（LV）at different postnatal developing times.Methods Healthy male SD rats of different age groups were recruited（1-，2-and3-week groups，1-and2-month groups，6-month grown group，and18-month aged group;n=5each）.Immunohistochemistry was performed on the coronal sections of brain of the rats perfused with paraformaldehyde.Results The expression of Msi1was observed in the SVZ of LV in all groups.Msi1-positive cells were small and round in shape，showing no or1～2short processes on the surface.The Musashi1-positive cells were unevenly dis-tributed.The number of them was reduced gradually with age.Conclusion Many Musashi1-positive cells are present in the SVZ of rat the whole life，with their number reducing gradually with age.They might play as neural stem cells.
Key words:RNA-binding proteins;Musashi1;neural stem cells;subventricular zone;rat
Musashi1（Msi1）是一种神经RNA结合蛋白，哺乳动物Msi1是果蝇Musashi蛋白的同源体，而果蝇Musashi蛋白是感觉神经前体细胞的不对称分裂所必需的［1-2］ 。实验证明，Msi1选择性地表达于神经干细胞内，在维持干细胞状态和其分化上起关键作用，被认为是哺乳动物神经干细胞的一个标记物［3～6］ 。Msi1通过与numb基因的mRNA相互作用，从翻译水平调节numb基因的表达，进而调节Notch信号的活动，最终影响神经干细胞的自我更新和分化 ［7］ 。Msi1主要分布于核周细胞质内。在发育中的哺乳类中枢神经系统及其干细胞中，Msi1有丰富表 达。在成年啮齿动物脑室下区（subventricular zone， SVZ）中，正在增殖的细胞内仍有Msi1表达［3-4］ 。单细胞培养证实，所有新生的神经干细胞都呈Msi1免疫反应阳性，在增殖中的多潜能神经祖细胞内Msi1也有表达，但在新生成的有丝分裂后的神经元内Msi1无表达。在体实验表明，Msi1的表达伴随着神经发生的进行而下调，至成年阶段仅有很低水平［8］ 。尽管如此，Msi1作为一种神经RNA结合蛋白在大鼠SVZ生后发育各阶段中的表达变化如何尚未见报道。
因此，本实验运用免疫组织化学方法，检测了大鼠生后不同时间侧脑室SVZ内Msi1的表达，为探讨神经系统发育提供形态学资料。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，由徐州医学院实验动物中心提供。分为7天、2周、3周、1月、2月、成年（6月龄）和老年（18月龄）7组，每组5只，共35只。
1.2 大鼠灌注固定 各组大鼠用戊巴比妥钠常规腹腔注射麻醉，打开胸腔，经心-升主动脉插管灌注。先快速灌注生理盐水，再用40g.L（4%）多聚甲醛灌注固定，灌注后的大鼠断头、暴露脑，在立体定位仪上将鼠脑冠状位分成前、中、后3段，相同固定液中后固定，4℃过夜，复移入15%蔗糖溶液，沉底后再移入30%蔗糖溶液，直至脑块再次沉底。取前段行连续冠状冰冻切片，片厚为30μm，切片用0.01mol.L的磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）漂洗。
1.3 免疫组织化学反应 按ABC试剂盒说明书的步骤，切片经3%H 2 O 2 和10%正常羊血清各处理30min后，入兔抗Musashi1多克隆抗体（1∶1000，Chemicon公司），室温2h后，4℃过夜。再入生物素化羊抗兔抗体（1∶200，武汉博士德公司）室温2h。复入ABC复合物（1∶200，美国Vector公司）37℃1h。除羊血清处理后直接入一抗之外，余各步骤间用0.01mol.L的PBS（pH7.4）摇洗3次，每次5min。然后用DAB试剂盒（武汉博士德）呈色10min。漂洗后用明胶裱片，贴片，干燥。梯度乙醇脱水;二甲苯脱脂，透明;中性树胶封固。镜检、拍照。阴性对照用0.01mol.L PBS替代一抗孵育，其他反应步骤相同。
1.4 图像分析 用LEICA DMCS图像处理与分析系统进行。从各年龄组每只大鼠的免疫组化反应切片中取胼胝体膝和前连合之间固定位置的3张切片，在高倍视野（×40）下分别计数侧脑室背外侧SVZ内Msi1阳性细胞数。计数时，不同年龄不同鼠脑反应切片间，每张切面测量区域位置相同，任选5个相同面积计数Msi1阳性细胞，平均值视为这张切片SVZ内的Msi1阳性细胞数，3张切片的平均值视为这只鼠脑的SVZ内的Msi1阳性细胞数。
1.5 统计学处理 结果用SPSS12.0统计软件包行单因素方差分析（one-way-ANOVA），两两比较采用最小极差法（LSD）进行统计学处理。以P&<0.05认为有统计学意义。
2 结 果
2.1 大鼠SVZ内Msi1阳性细胞的形态与分布 在 侧脑室的室管膜及其周围的SVZ内可见Msi1阳性细胞（图1），胞体呈小圆形，可见1～2个突起或无突起，细胞分布疏密不匀。在侧脑室背外侧角处的SVZ内，Msi1阳性细胞数量最多，并且沿胼胝体腹侧向外延伸，其延伸的长度随年龄增长而缩短;沿侧脑室外侧壁的SVZ内，Msi1阳性细胞数从背侧向腹侧逐渐递减;沿侧脑室内侧壁，仅见少量Msi1阳性细胞（图1）。所有用PBS替代Msi1一抗的切片均呈阴性。
2.2 大鼠SVZ内Msi1阳性细胞随年龄增长的变化 各组大鼠SVZ内Msi1阳性细胞的数量随年龄增龄而下降（图1）。计数的结果（表1和图2）显示，7天大鼠SVZ内Msi1阳性细胞数量最多，随年龄增长SVZ内Msi1阳性细胞逐渐减少，老年大鼠SVZ内仍然有一定数量的Msi1阳性细胞。单因素方差分析，F=11063.67，P&<0.05，说明总体有差异。LSD显示，7组间两两比较均有差异（P&<0.05）。统计分析结果与镜下形态学观察基本一致。 表1 各年龄组鼠脑SVZ相同面积内Msil阳性细胞数
3 讨 论
神经干细胞是神经发育学、神经细胞生物学与临床神经科学研究者共同关心的热点课题。神经干细胞在哺乳动物胚胎期神经系统中的分布具有较大的普遍性。许多研究报道，神经干细胞可以从胚胎期神经系统中的多个部位分离得到［9］ 。1992年Reynolds和Richards先后从成年鼠的纹状体和海马中分离出神经干细胞［10-11］ ，从而证明成年哺乳动物的大脑内存在神经干细胞，它们具有自我更新和多潜能分化能力，可在体外培养增殖，并能产生神经元和神经胶质细胞。研究表明，成年哺乳动物侧脑室SVZ内存在神经干细胞，该细胞沿嘴侧迁移流（ros-tral migratory stream，RMS）迁移至嗅球，不断分裂并分化为嗅球内的颗粒细胞和小球周细胞［12］ 。SVZ细胞中的神经干细胞在体内或体外培养的条件下能不断地分裂增殖［13］ 。Kukekov等［14］ 的实验表明，在成年人乃至老年人的侧脑室SVZ都存在神经干细胞，将该区域的脑组织在体外培养得到了能够分化为神 经元及神经胶质细胞的神经球。Gould等［15］ 发现， 在成年恒河猴大脑新皮层联络区不断地有新神经元形成，且认为这些新神经元来自SVZ;还有人［16］ 在成年小鼠体内也观察到类似现象。
本室早期用焦油紫染色显示，SVZ细胞分布于侧脑室（LV）外侧壁的室管膜下，从背侧向腹侧，SVZ细胞的层次逐渐减少至无;侧脑室内侧壁也分布有1～2层稀疏排列的SVZ细胞;这些细胞在形态学上具有未成熟细胞特点［17］ 。本实验发现，沿侧脑室外侧壁Msi1阳性细胞数从背侧向腹侧逐渐递减，在内侧壁处可见少量Msi1阳性细胞，与焦油紫染色结果相符合。提示Msi1阳性细胞可能是神经干细胞，但是Msi1阳性细胞这一分布特点的意义目前尚不清楚。
有实验报道，给大鼠腹腔注射5′-溴脱氧尿嘧啶（BrdU），在SVZ内BrdU阳性细胞数随年龄增长而下降［18］ 。本实验亦显示，在SVZ内Msi1阳性细胞的数量随增龄呈现减少的趋势。但本实验还发现，在老年鼠SVZ内仍然有一定数量的Msi1阳性细胞，提示在SVZ内Msi1阳性的神经干细胞可能终生存在，不过这些细胞可能处于功能静止状态，在内外环境的适宜刺激下可能重新启动增殖和分化，并形成新的神经元和神经胶质，替代衰老或受损的神经元，从而减轻或修复脑功能障碍。有研究报道，休克可引发SVZ神经前体细胞数量明显增多，而且这些细胞能够以链状迁移到损伤的纹状体［19］ 。
如何使在体神经干细胞的活性增强或重新激活，是一个重要的研究课题，其研究成果将为脑损伤、脑衰老及中枢神经退行性疾病的治疗提供新的治疗策略。
参考文献
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