【关键词】 肝肿瘤 肝细胞癌 DLK1蛋白 甲胎蛋白 免疫组织化学
肝癌是较为凶险的一种恶性肿瘤，好发于东南亚及非洲。肝癌在我国男、女性恶性肿瘤死亡率中分别排第2和第3位，每年有约11万人死于肝癌，约占全世界肝癌死亡人数的45％［1］。深入研究肝癌的诊断和鉴别诊断，特别是发现新的诊断指标，对于肝癌的防治有重要的意义。本研究通过在肝细胞癌（HCC)肝组织标本中联合检测甲胎蛋白（AFP）和DLK1蛋白，探讨DLK1蛋白对HCC的诊断意义。
1 资料和方法
1.1 临床资料 收集我院1999年—2005年经临床诊断及病理确诊的88例HCC标本。其中男性71例，女性17例；年龄19 69岁，平均44岁。
1.2 抗体 DLK1多克隆抗体由国家人类基因组南方研究中心韩泽广教授惠赐，AFP一抗、兔多克隆抗体、鼠单克隆抗体购于DACO公司。
1.3 方法 每个标本同时切取肝癌组织及对应的癌旁组织，每张切片厚度4 μm，10%甲醛固定。采用链酶菌抗生物素蛋白-过氧化酶法（SP法）进行免疫组化染色，用PBS替代一抗作为空白对照，正常组织作阴性对照，用已知AFP和DLK1阳性片作阳性对照。石蜡切片常规脱蜡至水，3% h3O2作用切片10 min，灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗，柠檬酸微波抗原修复，自然冷却后PBS冲洗，滴加一抗 (DLK1 和AFP均为1∶100倍稀释），37℃ 1 h取出PBS冲洗，滴加二抗（DLK1为兔多克隆抗体，AFP为鼠单克隆抗体），37℃ 30 min，取出PBS冲洗，DAB显色2 10 min，自来水终止反应，苏木精复染，烘干，中性树胶封片。
1.4 阳性结果的判断标准 癌细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性，无棕黄色颗粒为阴性。
1.5 统计学处理 采用χ2检验，P＜0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 HCC肝组织中AFP和DLK1表达 HCC组织中DLK1阳性率为56.8%(50/88)， DLK1阳性细胞在肝癌组织中呈散在或小片状分布，DLK1多分布在细胞质，部分分布胞外基质中（图1A）。而在癌旁肝组织中无DLK1阳性表达（图1B)。HCC组织中AFP阳性率44.3%(39/88)。AFP阳性细胞在肝癌组织中呈集聚性分布，AFP多分布在细胞质内（图1C）。癌旁肝组织中无AFP阳性表达（图1D）。的表达情况（免疫组化染色，×40） A. 肝癌组织DLK1表达；B. 癌旁肝组织DLK1表达；C. 肝癌组织AFP表达; D. 癌旁肝组织AFP表达
2.2 DLK1蛋白的表达与HCC临床病理特征的关联性分析 见表1。结果显示，60岁以上的HCC患者DLK1阳性率明显高于60岁以下者(P&<0.05)，DLK1蛋白的表达与其他临床病理因素无关（P＞0.05）。表1 DLK1蛋白表达与HCC临床病理特征的关系
2.3 肝癌组织AFP和DLK1蛋白表达的对比分析见表2。表2 肝癌组织AFP和DLK1蛋白表达的关系
3 讨 论
DLK1蛋白又叫脂肪前体细胞因子1，在细胞分化方面起到一定的作用，尤其在内胚层起源的肝细胞、呼吸道上皮细胞中有表达，随着胎儿胎龄的增加，正常组织中DLK1的表达逐渐减少。本组实验发现，DLK1可在HCC组织中阳性表达，在正常肝组织中不表达，这也许与癌细胞高度增殖有关［2］， 因此探讨其在肝癌组织中的表达对于HCC的诊断有重要意义。AFP是由胚胎卵黄囊细胞、胎儿肝细胞和肠道细胞合成的一种糖蛋白，通常情况下，人们认为AFP是HCC较特异、灵敏的标志物，AFP的表达与癌细胞的分化程度、肿瘤的大小有关，分化程度高或低的癌不产生或很少产生AFP，中等分化的癌细胞的形态、功能与胚胎肝细胞相似，产生AFP的能力较强［3］。
本组实验结果显示，DLK1在HCC中阳性率较高，这一点与AFP极其相似。相比较而言，同等分化的HCC中DLK1的阳性表达要比AFP为高，因此我们认为在HCC免疫指标中DLK1比AFP更具有诊断价值。
另外，根据我们的体会，在病理学水平检测DLK1蛋白的表达过程中，要注意抗体的稀释度、孵育时间、显色时间的控制，尽量减少人为因素造成的实验结果的误差，以保证实验结果的可靠性。
参考文献
［1］ Schafer DF， Sorrell MF. Hepatocellular carcinoma ［J］. Lancet， 1999，353 (9160):1253-1257.
［2］ Huang J， Zhang X， Zhang M， et al. Up-regulation of DLK1 as an imprinted gene could contribute to human hepatocellular carcinoma ［J］. Carcinogenesis， 2007，28(5):1094-1103.
［3］ 张明辉，王江平，李焱萍，等. 97例原发性肝癌患者AFP变化的分析［J］. 西医结合">中西医结合肝病杂志，1999，9（5）：39.