心肌祖细胞、内皮祖细胞关于梗死心肌的修复作用

【关键词】 心肌祖细胞;，内皮祖细胞;，心肌梗死;，细胞心肌成形术
　　 摘要 :细胞心肌成形术通过细胞移植为心肌梗死区域提供有功能的心肌细胞并恢复血供，已经成为治疗心肌梗死的希望。但是对于移植细胞的选择仍然众说纷纭。联合移植分化方向明确的祖细胞代替混杂干细胞群，以减少移植后不良反应逐渐成为今后研究的方向。其中心肌祖细胞、内皮祖细胞潜力巨大，已经成为该领域的研究热点。
　　关键词 :心肌祖细胞;　内皮祖细胞;　心肌梗死;　细胞心肌成形术
　　 心肌缺血梗死后，心肌细胞坏死、凋亡造成数目减少，心室重构促使心力衰竭发生。在心肌梗死的治疗中，增加有功能的心肌细胞和重建梗死区心肌血供至关重要。尽管药物、介入治疗和外科手术治疗已取得了长足的进展，可以部分地恢复心肌梗死区的血供，心肌梗死的死亡率仍未得到满意的控制，仍然无法再生心肌细胞。近年来，细胞心肌成形术（cellular cardiomyoplasty）治疗心肌梗死已经成为理论及临床研究的热点。各种临床前动物实验表明，干.祖细胞移植到梗死心肌处能使梗死区灌注加强和心肌细胞再生，改善心脏功能，目前已应用于临床的主要有单个核细胞群（mononuclear cells，MNCs）和间充质干细胞群（mesenchymal stem cells，MSCs）。但是移植成分复杂，随着临床应用例数的增多，不良反应的报告也日趋增多，尤其是心律失常等问题。因此，细胞移植成分也逐渐向纯度高、组成均一的组织定向干细胞群（tissue-committed stem cell，TCSC）过渡，而存在于体内的心肌祖细胞（cardiac progenitor cell，CPC）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）作为细胞心肌移植的良好供体，显示出其巨大的潜力。
　　1 CPC及EPC
　　1.1 CPC CPC是一类能够定向分化为成熟且有功能的心肌细胞的前体细胞。
　　1.1.1 CPC的来源 目前认为，CPC主要来源于心脏本身和骨髓两个部位。来源于心脏的CPC早在上世纪90年代即有报道，且不断发现新的细胞表型。Hidemasa等［1］ 报道在小鼠心肌层中存在一类 CPC，在5-azacytidine的诱导下可以向心肌细胞分化。Beltrami等［2］ 成功地从成年大鼠心脏中分离出一类具有心脏干细胞性质的特殊细胞，能进一步分化为心肌细胞，并形成可以供血的小血管。2005年Laugwitz等［3］ 发现，CPC中有一种新的细胞型，虽然临近出生时这些细胞数减少，但仍可在出生后的啮齿类动物心脏中检出。此表型CPC可进行人工培养，若环境适宜，可分化为成熟的心肌细胞。而来源于骨髓的CPC则在2004年由Kucia等［4］ 首次报道，这些CPC可在心肌梗死时动员入血，并能在梗死区域分化为成熟且具有功能的心肌细胞（表达β-肌球蛋白重链β-MHC;心肌特异性肌钙蛋白I，c-tro-ponin-I）。而在此之前，Deb等［5］ 在2003年曾经对异性骨髓移植患者心脏进行尸检并分析其Y染色体阳性的心肌细胞，提出了心肌细胞是由来源于骨髓的祖细胞分化形成的观点。虽然目前在骨髓和心脏本身都发现了有定向分化能力的CPC，但是，在临床应用时，心脏本身的CPC则存在着无法分离、培养的困难，搞清其扩增的机制并促使其在心肌梗死区扩增仍需一定时日。而骨髓来源的CPC不仅可以分离培养，定向移植至心肌梗死区;而且可运用生物动员剂将其动员入外周血，使其向心肌梗死区趋化，临床应用前景更为广泛。
　　1.1.2 CPC分子的表面标志 Kucia等4］ 发现，来源于骨髓的CPC主要表达早期心肌细胞谱系标志物Nkx2-5.Csx、GATA-4和MEF2C。研究表明，小鼠的CPC主要表达CXCR4 + .Sca-1+ .lin - .CD45- ，在人体内CPC则主要表达CXCR4+ .CD34 + .AC133 + .CD45 - ，而心脏来源的CPC则主要为Sca-1 + .Nkx2-5 - .lin-［1-2］ 。
　　1.2 EPC EPC是一类能循环、增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。以往认为，EPC仅见于胚胎时期，但近年来越来越多的证据表明，在成年个体中也存在少量的EPC。
　　1.2.1 EPC的来源 1997年，Asahara等首次报道，利用免疫磁珠细胞分选的方法从成人外周血MNCs中分离出一种单个核细胞，体外培养呈梭形，可形成管腔样结构，且能够表达内皮细胞表型。此后，又陆续发现骨髓和脐带血中均存在EPC。Shi等［6］ 研究发现，在移植了同种异基因骨髓的狗主动脉内，植入可阻止血管直接长入的管状物，12周后利用高敏微卫星PCR，发现其内表面出现的EPC完全来源于供者骨髓。Quirici等［7］ 也认为，较原始的EPC主要存在于骨髓中，但是外周血中也有EPC的存在。Kalka等［8］ 认为，健康成人外周血每1×10 6 个MNCs中含有0.05%，即5×10 2 个EPC。
　　1.2.2 EPC分子的表面标志 Asahara筛选的时候认为EPC是CD34+ ，目前认为，EPC不表达内皮细胞的标志，主要鉴别的标志为CD133 + .CD34 + .VEG-FR-2+ （在人类称之为KDR，在小鼠称为flk-1）。Murasawa等［9］ 通过成人外周血EPC与大鼠心肌细胞共同培养发现，人EPC能分化为功能活跃的心肌细胞，且并没有发生细胞融合。这是一个值得注意的问题，也许因为EPC和CPC的表面标志有部分重合，通过CD133 + .CD34 + 鉴定的EPC群中含有CD133 + .CD34+ .Nkx2-5 + CPC，仍有待进一步的研究。
　　2 CPC、EPC与心肌修复
　　在心肌梗死的修复及再生的病理生理过程中，不仅需要在梗死区再生有功能的心肌细胞，还需要重建梗死区及周围边缘的血供，新生血管的形成也有利于心肌细胞的再生。而机体本身存在着这样一个自我保护的机制，可通过心肌梗死后发出特定的信号，例如炎性因子（inflammatory cytokines，IC）、血管内皮生长因子（VEGF）等，动员骨髓及外周血的CPC、EPC，使其增多并产生一定的修复作用。Woja-kowski等［10］ 检查了56名急性心肌梗死后12h内ST段抬高患者的外周血，发现MNCs中表达CPC特异性标志（Nkx2-5.Csx、GATA-4、MEF2C）和EPC特异性标志（CD133、CD34、VE-cadherin、vWF）的细胞显著增多。Urbanek等［11］ 则认为，在人的心脏有一群心脏干细胞（cardiac stem cell，CSC），它们在心肌梗死 后被活化并向梗死区迁移。上述现象表明，机体确 实存在着应激的自我保护机制，且与CPC、EPC有关。然而，机体的自我保护机制作用是微弱的，有研究显示，心肌梗死时，由于心脏局部没有足够的干.祖细胞为其再生所需，或是诱导动员进入循环的干.祖细胞数量不足，结果是瘢痕形成而不是心肌细胞的再生。
　　研究表明，CPC、EPC的修复作用是确实有效的。Orlic等［12］ 将转基因鼠的Lin- .c-kit+ 细胞注射到心肌梗死小鼠梗死边缘正常心肌中，9天后有再生的心肌组织。Linke等［13］ 报道在狗的心肌梗死模型中，心脏本身的CSC可以被肝细胞生长因子（hep-atocyte growth factor，HGF）活化，并促进梗死心肌的显著修复。因骨髓来源的表达Nkx2-5.Csx、GATA-4、MEF2C的CPC在2004年由Kucia首次发现，因此目前关于此类骨髓来源的组成均一的细胞在体修复作用报道还较少，骨髓干细胞群的修复作用报道较多。同时EPC的研究也较多。Kawamoto等14］ 将成人外周血分离出的EPC标记后静脉注射给心肌梗死3h的无胸腺大鼠，发现EPC在缺血区积聚并整合到局部血管中，心功能改善，缺血区血管密度增加，左心室瘢痕较对照组小，可查到人特异性内皮细胞的标志。最有说服力的来自于临床实验，Assmus等［15］ 通过对20名急性心肌梗死（AMI）患者随机分组接受外周血EPC移植在梗死血管处，4个月后，移植EPC组的左心室射血分数（LVEF）提高，梗死心肌的存活率提高。通过以上研究可以发现，EPC可以通过为心肌梗死区重建血供来减少梗死面积，改善心功能。而CPC的发现则为增加梗死区有活性的心肌细胞带来了希望。而之前有文献研究表明，经过5-aza诱导为心肌细胞形态的MSCs移植到梗死区比单纯的MSCs移植存活率更高。所以有理由相信分化程度更高的CPC、EPC的联合移植所产生的心肌修复作用也将强于单纯的MSCs移植，而不良反应也会更少。
　　3 CPC、EPC的动员剂及其动员机制
　　目前，对于MSCs移植治疗心肌梗死的方式主要包括:①开胸后心肌梗死部位局部注射植入;②经冠状动脉植入;③通过介入方法心内膜下植入;④经外周静脉途径植入。上述移植技术各有优点，但尚存在不足。迄今为止，虽有移植EPC的应用报道，但尚未见CPC的应用报道。
　　近年来，研究焦点逐渐集中到了动员剂的使用，应用动员剂将MSCs从骨髓中动员到外周血中，从而使外周血干.祖细胞达到治疗所需的数量，利用其自动归巢（homing）到梗死区并在心肌微环境下分化的特性，参与坏死心肌的修复。该方法不开胸，创伤小，疗效较为显著。但是迄今为止，干.祖细胞动员、归巢及分化的具体机制还不太清楚。
　　3.1 动员剂的种类 近年来，基础及临床领域对于干.祖细胞动员剂的选择众说纷纭。目前，主要应用于体内的为细胞因子和药物动员剂，而传统的动员剂为粒细胞集落刺激因子和干细胞因子。早在1998年，Orlic等使用粒细胞集落刺激因子和干细胞因子动员2月龄小鼠，5天后结扎小鼠冠状动脉，术后继续用3天，发现小鼠外周血EPC增加，心肌梗死区可见新生的心肌细胞带。近年来的研究表明，他汀类药物，促红细胞生成素、VEGF等亦具有动员作用，它们均可以显著促进冠心病患者外周血EPC的数量，增强血管新生［16～18］ 。此外，还有中药类动员剂的报道，王兴祥等［19］ 在体外培养EPC并加入不同浓度银杏叶提取物，发现在细胞水平，银杏叶提取物能显著增加外周血EPC的数量并改善其功能，张芙荣等［20］ 发现，葛根素亦有同样的作用。显然，如果在体水平中药类动员剂也有同样的效果，无疑将会成为传统中医药研究及发展的又一亮点。 转贴于 3.2 从外周血向心肌梗死区归巢的机制 干.祖细胞由外周血向心肌梗死区归巢的机制较为复杂，目前提出的通路机制包括了众多的细胞因子，但是很多还只是停留在现象的研究上。具体机制的研究主要集中在CXCR-4.SDF-1和HGF.c-met。Kucia等［4］ 在Costar Transwell24-well细胞培养装置的下层分别填充富含HGF、SDF-1的条件培养基，在其上层放入CXCR4 + CD34 + AC133 + CD45- 的BM-MNC，RT-PCR分析结果表明，高度表达Nkx2-5.Csx、GATA-4和MEF2C的细胞群向含HGF、SDF-1的上层培养基趋化，而当分别采用HGF、SDF-1的阻断剂K252a和T140后，该现象消失;该学者还发现，如果将HGF、SDF-1的条件培养基换成AMI后48h的心肌匀浆液，能发现同样的现象。Abbott等［21］ 通过腺病毒载体将SDF-1基因转染到心肌梗死小鼠的梗死区和边缘区以及正常小鼠，同时运用CXCR4的特异性阻断剂AMD3100，发现SDF-1.CX-CR4是心肌梗死后BM-MNC向心肌梗死区归巢的主要作用机制，但在无心肌梗死的正常小鼠则未发生这一现象。该学者认为，SDF-1.CXCR4是心肌梗死后BM-MNC向心肌梗死区归巢的主要作用机 制，同时也说明在心肌梗死区另存在其它特异性的 调控机制，这是正常小鼠所没有的。
　　4 展 望
　　目前，已有较多利用自体干.祖细胞移植治疗心肌梗死的临床报道。但是，由于其移植细胞成分较为复杂，缺乏特异性靶向性，因此，在发挥确切疗效的同时其不良反应亦有发生，客观评估其治疗的安全性还需对患者进行更长期的随访研究。理论上认为，联合移植CPC、EPC既可增加心肌供血，又可替代梗死心肌;由于移植细胞成分单一，不良反应较少，与目前混合MSCs的移植相比，CPC、EPC联合移植不仅保留了其优点，而且可有效地减少其不良反应。但是，从应用角度来看，为实现CPC、EPC联合移植的目标，仍需对以下问题开展深入的研究，如:①CPC、EPC的分离、鉴定的问题;②CPC向心肌细胞方向分化的效率问题;③在阐明移植细胞动员、归巢机制的同时，确定有效的动员剂、趋化剂;④体内动员和体外分离培养后心脏局部给药，哪种更为有效。有理由相信，随着以上问题的解决，CPC，EPC治疗心肌梗死将逐步进入临床阶段，为心肌梗死的治疗开辟新途径。
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