【摘要】 目的 探讨冬眠心肌细胞内p38MAPK、TNF-α mRNA的变化和意义。方法 10例行冠状动脉搭桥术的冠心病患者，术前1周内用多巴酚丁胺超声负荷试验结合多普勒组织成像确定冬眠心肌及正常心肌的位置，搭桥术中根据检测结果进行取材（分别取正常心肌和冬眠心肌），并经电镜证实。Western-blot法检测p38MAPK蛋白表达情况，原位杂交法检测TNF-α mRNA的活性。结果 冬眠心肌细胞内p38MAPK、TNF-α mRNA的表达较正常细胞高；冬眠心肌p38MAPK与TNF-α mRNA表达相关（r＝0.849， P＜0.05)。结论 慢性缺血缺氧时，心肌细胞内p38MAPK、TNF-α mRNA表达增加。TNF-α mRNA促进p38MAPK的活化，p38MAPK、TNF-α是冬眠心肌形成的重要分子生物学因子。
【关键词】 冬眠心肌 肿瘤坏死因子α p38MAPK
Abstract：Objective To study the changes and significance of p38MAPK and TNF-α mRNA in hibernating myocardium （HM）.Methods Ten patients with coronary artery disease scheduled for bypass surgery were subjected to preoperative dobutamine stress echocardiography and Doppler tissue image to locate the position of HM. The specimens of normal myocardium (NM) and HM were taken during the operation， and then confirmed by electron microscopy. p38MAPK and TNF-α mRNA were detected by using Western blot and in situ hybridization respectively.Results The expressions of p38MAPK and TNF-α mRNA in HM were significantly increased， compared with that in NM. p38MAPK and TNF-α mRNA were positively correlated （r=0.849， P＜0.05).Conclusion The expressions of p38MAPK and TNF-α mRNA are increased in ischemic myocardial cells. As TNF-α mRNA promotes the activation of p38MAPK， they two may be important factors in the molecular biology of HM formation.
Key words: hibernating myocardium; TNF-α; p38MAPK
冬眠心肌(hibernating myocardium， HM)是由慢性冠状动脉缺血引起、能够保存残余收缩储备力因而对正性肌力刺激起阳性反应的一种心肌的特殊状态，通过增加血流或降低氧耗，其功能可部分或完全恢复。HM是心肌功能为适应降低的血流供应而发生的匹配性下降，是存活的心肌在低灌注下防止自身坏死的自我保护状态。HM已成为近年来冠心病研究领域中的热点之一，但其形成的确切机制尚不完全清楚。近年来发现TNF-α能够促进心脏重构［1］，心脏重构指心肌细胞外间质数量和质量的变化及心肌细胞的凋亡，此外丝裂素活化蛋白激酶家族（mitogen activated protein kinases， MAPKs）可能参与了HM的形成。本研究观察冠心病患者HM细胞的p38MAPK、TNF-α mRNA 的表达，并分析它们之间的关系，初步探索HM形成的分子生物学机制。
1 材料和方法
1.1 实验材料 兔抗P-P38购自美国SANTA CRUZ公司；碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG、TNF-α mRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物公司。
1.2 心肌标本来源 10例心肌标本均来自2004年8月—2006年3月在扬州大学附属医院心胸外科行冠状动脉搭桥手术（CABG）的冠心病患者，冠状动脉造影至少有1支冠状动脉狭窄程度大于85%，男7例、女3例，平均年龄（58.3±4.2）岁，病史均超过18个月。术中取HM及正常心肌（normal myocardium， NM）。
1.3 HM定位
1.3.1 技术方法 采用多巴酚丁胺超声负荷试验(DSE) 结合组织多普勒成像（DTI）技术，将左心室按美国超声心动图协会方法分为相对应的16个节段。
1.3.2 DSE检查方案 试验分为静息、多巴酚丁胺10 μg/(kg·min)、30 μg/(kg·min) 3个级别，每级负荷维持5 min。于每级负荷时记录超声图像，并记录常规12导联ECG和血压。终止指标为:出现心绞痛；收缩压＜80 mmHg或≥220 mmHg(1 mmHg=0.1333 kPa)；出现严重心律失常；心率达到该患者年龄估算最高心率的85%；同一节段运动出现双相反应。
1.3.3 室壁节段运动异常的判定 DTI测量心肌收缩期峰值平均运动速度。如静息时平均运动速度低于正常速度，负荷10 μg/(kg·min) 多巴酚丁胺时心肌运动速度较静息时明显增高，负荷30 μg/(kg·min) 多巴酚丁胺时心肌运动速度反而减低，此时定义心肌运动呈双相反应，判定为HM。
1.4 心肌处理 4%戊二醛、10％甲醛〔含0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）〕、液氮固定， 在电子显微镜下观察确认后分别进行原位杂交、Western-blot、TUNEL试验。
1.5 原位杂交法检测TNF-α mRNA 按试剂说明书进行操作，原位杂交探针序列为：
（1）5′-GAGCA CTGAA AGCAT GATCC GGGAC GTGGA-3′
（2）5′-GAGTG ACAAG CCTGT AGCCC ATGTT GTAGC-3′
（3）5′-GGGCA GGTCT ACTTT GGGAT CATTG CCCTG-3′
1.6 Western-blot法检测p38MAPK蛋白含量 心肌组织在冰浴的匀浆缓冲液中研碎成匀浆，4℃、1000 r/min离心15 min，取上清。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，根据蛋白浓度取所需量的组织蛋白，加入1/3体积的4倍蛋白处理液，96℃ 100℃水浴变性3 5 min；经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离；电转至孔径为0.45 μm的硝酸纤维素膜（NC膜）上，转移完成后，加入封闭液，室温封闭5 h；然后加入用封闭液稀释的一抗，4℃温育过夜；漂洗缓冲液洗膜3次，每次5 min，加入相应的碱性磷酸酶标记的二抗(羊抗兔，IgG-AP)室温孵育2 h； 漂洗缓冲液、双蒸水洗膜后，以NBT/BCIP显色，显色反应达到要求后，水洗终止反应。ImageJ图像分析软件测定平均灰度值（间接反映蛋白表达水平）。
1.7 统计学处理 计量数据以±s表示，统计软件采用SPSS 13.0。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 病理结果 电镜下可见HM与NM比较有以下一些特点：心肌纤维数量减少、稀疏，心肌纤维数量减少主要集中在细胞核周围。心肌纤维数量减少时细胞容量无变化（这一点与细胞萎缩不同），心肌细胞内出现糖原积淀；心肌细胞内线粒体体积变小，散在分布于细胞胞质内；细胞核扭曲，可见散在的异染色质；心肌细胞内没有发生小泡、水肿、染色体肿胀、细胞核崩解、脂质沉积等细胞坏死和萎缩时常见的变化（图1）。
图1 电镜下HM心肌微结构（× 1200）
2.2 原位杂交结果 HM TNF-α mRNA胞质着色呈棕黄色（图2），原位杂交用Leica Qwin图像分析仪测定平均灰度值。HM组 TNF-α胞质平均灰度值明显高于NM组（P＜0.05）。见表1。表1 2组p38MAPK及TNF-α mRNA测定的灰度值比较
2.3 Western-blot检测结果 HM组p38MAPK蛋白条带的平均灰度值明显高于NM组（P＜0.05）。见表1 。
2.4 HM组TNF-α mRNA表达水平与p38MAPK蛋白表达的相关性 HM组 TNF-αmRNA胞质平均灰度值与p38MAPK蛋白表达的灰度值成正相关（r=0.849，P＜0.05)。
3 讨 论
TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，参与介导人体多种疾病的发生、发展。心肌细胞膜存在TNF-α受体，心肌细胞内TNF-α过度表达引起炎症反应使心肌细胞收缩力下降、心肌肥大及心肌细胞纤维化，最终导致心功能不全［2］。
以往我们的研究发现TNF-α的高表达促进心肌细胞凋亡，从而参与冠心病患者冬眠心肌的形成［7］。但TNF-α高表达促进心肌细胞凋亡参与冠心病患者冬眠心肌形成的具体机制尚不清楚，是否也可以激活p38MAPK通路国内目前尚无研究。本研究HM取自冠心病患者，并经电镜证实。研究观察到冠心病患者HM中TNF-α mRNA及p38MAPK的蛋白表达较NM明显升高，且TNF-α mRNA与p38MAPK的表达有很好的相关性。结合以往的研究结果，我们认为心肌慢性缺血缺氧使得TNF-α表达增加，高表达的TNF-α促进p38MAPK活化，进而诱导心肌细胞凋亡参与冠心病患者冬眠心肌形成。心肌细胞凋亡在血运重建术后心功能恢复差的过程中发挥重用作用［8］，既然研究表明TNF-α单克隆抗体预处理能明显减轻心肌细胞凋亡程度［9］，那么临床能否应用其治疗有HM存在的冠心病患者，减少心肌凋亡数目改善心功能，提高血运重建治疗的效果，还有待我们进一步研究证实。
本研究存在的不足之处是收集的病例数有限，尽管获得的冬眠心肌均经电镜证实，但采用DSE结合DTI对HM进行定位，与HM检测的“金标准”——FDG-PET相比特异性及敏感性均降低，使得取材的成功率大大降低。
参考文献
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