【关键词】 脑出血
摘要 :目的 探讨急性脑出血大鼠脑内热休克蛋白HSP 70 与凋亡蛋白Bcl-2的表达变化。 方法 成年雄性SD大鼠随机分为生理盐水对照组与脑出血组（36只），采用自体血注入方法建立大鼠脑出血模型。免疫组织化学法检测HSP 70 与Bcl-2的表达。 结果 免疫组化示HSP 70 与Bcl-2在脑内广泛表达，模型组HSP 70 出血后6h出现阳性细胞表达，24h有较明显的表达，72h阳性细胞表达仍在增加;Bcl-2阳性细胞12h表达开始增加，48h达高峰。 结论 急性脑出血后大鼠脑内HSP 70 与Bcl-2表达均增强，二者均以皮质和海马区表达为主。
关键词 :脑出血;免疫组织化学;大鼠
Abstract:Objective To investigate the expression of HSP 70 and Bcl-2in rat brain after acute intracerebral hemorrhage（ICH）.Methods Rats were randomly pided into a NS control group and a model group（n=36each）.ICH model was es-tablished by injecting50μl of autologous blood into the caudate nucleus.At six time points（6h，12h，24h，48h，72h and1w after intracerebral hemorrhage）the expressions of HSP 70 and Bcl-2were examined by immunohistochemistry.Results It was found that HSP70and Bcl-2were expressed extensively in the rat brain.HSP 70 and Bcl-2expressions reached the peak at72h and48h，respectively.Conclusion The expressions of HSP 70 and Bcl-2are increased after cerebral hemorrhage.The changes，mainly in the cortex and hippocampus，are related to the degree of injury，the time elapsed and the location of the affected region.
Key words:intracerebral hemorrhage;immunohistochemistry;rat
近年来研究表明，细胞凋亡是出血性脑损伤的重要机制之一，Bcl-2是一种凋亡抑制基因，在细胞凋亡调节中起到重要作用;而HSP 70 是一种应激保护蛋白，可抑制应激激活蛋白激酶，并发挥其分子伴侣作用，在线粒体上的HSP 70 可能通过对变性的细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2加以修复或防止其被降解，恢复其凋亡抑制功能［1］。本实验拟在探讨此两种蛋白在急性脑出血大鼠脑内的表达变化规律及二者之间的可能关系。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 健康成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠72只，体重220～250g，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.1.2 仪器 动物立体定位仪（江湾二型）;100μl微量进样器（浙江省医用器械厂）;KD1508转轮式切片机（浙江金华科迪仪器设备有限公司）;OLYMPUS光学显微镜（日本）。
1.1.3 主要试剂与药品 鼠抗Bcl-2单克隆抗体与鼠抗HSP 70 单克隆抗体（美国Santa Cruz Bio Tech公司产品）;即用型二步法免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒（均为北京中山生物科技有限公司产品）;10%水合氯醛、PBS缓冲液及其他试剂均为国产分析纯级。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组与处理 大鼠随机分为对照组（NS组）、模型组（出血组），时间点为6，12，24，48，72h，1周，每时相点各取大鼠6只。
1.2.2 模型制备 参照Yang等［2］ 报道的方法改进，根据《大鼠脑立体定位图谱》［3］ 确定尾状核的位置:前囟前0.2mm，矢状缝向右3.0mm，深6.3mm为注射点。大鼠经10%水合氯醛（350mg.kg）腹腔麻醉俯卧位固定于立体定位仪上，头皮正中消毒后矢状位切开约1.5cm，暴露前囟点，据图谱调整立体定位仪于注射点（A0.2mm，L3.0mm，V6.3mm），钻颅打孔（直径约1mm）将鼠尾置于40℃水温浴10min后取出擦干消毒，距离鼠尾末端3cm处剪断，用微量进样器吸取新鲜血液约50μl，迅速插入已钻好孔内，进针6.3mm（相当于尾状核位置），注射时间不少于15min，留针10min后缓慢退针，钻孔用骨蜡封闭，局部碘伏消毒后，缝合切口皮肤。大鼠清醒后无偏瘫体征（Longa评分）或血液沿针道反流者弃用。
1.2.3 免疫组织化学 造模成功后大鼠分别于各时相点经10%水合氯醛深度麻醉后，经升主动脉快速灌注37℃生理盐水100ml，然后以250ml固定液（4℃0.01MPB pH7.44%多聚甲醛）灌注固定脑组织，30min内灌完，取全脑，去除小脑和脑干，置于上述固定液中后固定24h，继入20%、30%蔗糖液（4℃pH7.4），直至组织块沉底。将固定脑组织放在恒冷切片机上切取30μm厚的连续冠状切片，于针道前1mm处向背侧随机隔6片取一组邻片。HSP 70 、Bcl-2均采用漂染法，所有操作均按北京中山公司即用型二步法检测试剂盒说明书进行，脑组织切片用2%H 2 O 2 去离子水消除内源性过氧化物酶，依次加入一抗（HSP 70 1∶150、Bcl-21∶100），二抗试剂盒，各步间以0.01mol.L PBS缓冲液振洗，DAB充分显色5min，常规脱色、透明、封片。以PBS代替一抗做阴性对照。所有结果在10，20，40倍目镜下观察，采用40倍目镜计数每张脑片4个视野，1只大鼠测2张脑片，获得8个数值，取其均数为1只大鼠的最终结果。
1.3 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件包进行数据分析，各组数据以ˉx±s表示，两两比较用t检验。
2 结果
2.1 血肿形态观察 肉眼见出血位于右侧基底节区，出血灶直径约3～4mm，说明造模成功，术后24h见术侧脑弥漫性肿胀，术后第3天血肿有所吸收，术后第7天明显吸收（图1）。 图1 大鼠脑出血后血肿形态观察 （略）
2.2 阳性细胞表达特点
2.2.1 形态学观察 各组大鼠脑组织HSP 70 与Bcl-2阳性细胞染色均以胞质有棕黄色物质沉积为主，并可显示细胞轮廓。见图2。
图2 出血侧大鼠脑组织皮质48h阳性细胞表达（×400）（略）
A.HSP 70 阳性细胞 B.Bcl-2阳性细胞
2.2.2 表达时相与部位 对照组HSP 70 偶有表达，模型组以造模后6h出现阳性细胞表达，术后24h有较明显的表达，术后72h最为显著;而Bcl-2在造模后12h出现阳性细胞，48h达高峰。HSP 70 在脑内广泛表达，主要见于海马、纹状体和皮质中;Bcl-2阳性神经元集中于出血侧皮质、海马CA1、CA2区及基底节区;二者在血肿区几乎未见阳性细胞表达。
2.2.3 阳性细胞表达的量 见表1，2。
表1 各组各时相点血肿周围皮质HSP 70 阳性细胞数（略）
生理盐水组各时相点均见少量阳性细胞表达，组内比较:P&>0.05;与同时相点生理盐水组比较:P&<0.05
表2 各组各时相点出血侧皮质Bcl-2阳性细胞数（略）
生理盐水组各时相点均见少量阳性细胞表达，组内比较:P&>0.05;脑出血组与同时相点生理盐水组比较:P&<0.05
3 讨论
了解脑内出血后脑损伤的发展对于确定治疗方案是很重要的。实验研究表明，脑内血肿周围及其远隔区域存在缺血，直至全脑的广泛损害［4］ 。HSP 70 是生物细胞在各种应激状态下发生热休克反应所合成的热休克蛋白，其主要生物学功能是起分子伴侣作用，正常脑组织中含量较少。在脑出血时，第1天即出现HSP 70 表达，至少持续5天，主要表达部位在血肿周围［5，6］ ，以神经细胞为主。本实验研究表明，生理盐水组可有少量阳性细胞表达，各时相点无明显差别，而脑出血后6h出现阳性细胞表达，24h见大量表达，48～72h达高峰，7天时仍见表达。此与血肿压迫致缺血半暗带形成，诱发HSP 70 的表达，从而对神经细胞起到保护作用有关。
Bcl-2是一种原癌基因，为抗凋亡基因，具有促进细胞生存的作用，位于凋亡调控基因网络的关键部位［7］ ，可抑制细胞程序化死亡（PCD）。本实验显示，大鼠脑出血后6h偶见阳性细胞表达，48h达高峰，Bcl-2的这种变化可能是神经自我保护机制之一。与其在脑出血损伤时抑制氧自由基、阻止促凋亡基因信号传递、抑制Ca 2+ 的释放等有关。
既往研究表明，在线粒体参与的胞质程序化死亡的途径中，表达在线粒体上的HSP 70 可能通过对变性的细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2加以修复或防止其被降解，恢复其凋亡抑制功能。本实验中，在脑出血术后第1天，HSP 70 、Bcl-2的表达均增高，第3天达到高峰，至第7天减少，与脑组织在第3天损害严重的变化规律一致。结合既往的研究:二者均在线粒体上有表达、均有抗氧化损伤作用、对一些调亡刺激因子引起的细胞调亡均有抑制作用等，综合以上资料，二者在脑出血抗凋亡作用中似存有协同作用，但具体机制尚待进一步深入研究。
参考文献
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［2］ Yang GY，Betx AL，Chenevert TL，et al.Experimental intracerebral hemorrhage:relationship between brain edema，blood flow，and blood-brain barrier permeability in rats［J］.J Neurosurg，1994，81（1）:93-102.
［3］ 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.北京:人民卫生出版社，1991:35.
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［5］ Matx PG，Sundaresan S，Sharp FR，et al.Induction of HSP 70 in rat brain following subarachnoid hemorrhage produced by endovascular per-foration［J］.J Neurosurg，1996，85（1）:138-145.
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