斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞周期的影响及分子机制的分析

【摘要】 探讨斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞周期的影响及其分子机制。【方法】取细胞生长期的LAC细胞，分别加入2.5、12.5、25μg/mL的斑蝥酸钠，20μg/mL羟基喜树碱（HCPT），并以生理盐水作用阴性对照，每组均设3个复孔；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞增殖抑制作用；采用流式细胞仪定量检测药物作用后肿瘤细胞凋亡及p53、bcl2基因的蛋白表达。【结果】斑蝥酸钠具有明显的抑制人肺癌LAC细胞增殖的作用，其抑瘤效应优于羟基喜树碱(HCPT)组。斑蝥酸钠作用于肺癌LAC细胞后引起S期细胞明显减少，细胞被阻止于G0/G1期，部分细胞发生凋亡，效应优于HCPT（P＜0.01）。斑蝥酸钠作用后，LAC细胞的p53基因表达上调，而bcl2基因表达下调。【结论】斑蝥酸钠抑制人肺癌LAC细胞增殖的作用可能与其能上调p53基因，下调blc2基因，诱导LAC细胞凋之有关。
【关键词】 斑蝥酸钠 药理学 肺肿瘤 中药疗法 细胞凋亡 基因表达调控 细胞培养
　　信号传导在细胞生长、增殖等调控中起重要作用，信号通路中不同组分的改变都会导致细胞增殖失控，产生癌变。通过阻断肿瘤细胞信号传导系统引起肿瘤细胞周期阻滞来阻抑肿瘤细胞生长、促进凋亡或死亡，正成为肿瘤学实验研究的热点［1］。斑蝥素是斑蝥体内提取出来的有效成分，斑蝥酸钠是斑蝥素的半合成衍生物，其抗肿瘤作用确切，毒性和刺激性较斑蝥素轻，对肝癌、食管癌、肺癌和胃癌等恶性肿瘤有良好疗效，并已长期应用于肿瘤的临床治疗［2］，但其作用机制尚未明了。我们选择了两个与细胞增殖、分化和凋亡密切相关的肿瘤基因p53基因和bcl2基因，检测其蛋白的表达，以探讨斑蝥酸钠引起肺癌LAC细胞周期的影响及其初步分子机理。
　　1 材料与方法
　　1.1 药物 斑蝥酸钠注射液为贵州神奇制药有限公司产品，批号015028；羟基喜树碱(HCPT)为湖北省黄石飞云制药公司产品，批号003021。
　　1.2 人肺癌LAC细胞株 由广州军区总医院肿瘤分子生物学研究所细胞室惠赠，用含体积分数为10%小牛血清（FCS）的RPMI1640培养液进行传代培养。
　　1.3 主要试剂 RPMI1640细胞培养液为美国GIBCO公司产品；胰蛋白酶（Trypsin）为Serva产品； FCS购于华美上海分公司；四甲基偶氮唑盐（MTT， 美国SIGMA公司）；二甲基亚砜（DMSO， 美国SIGMA）；鼠抗人单克隆抗体p53、鼠IgG（ 400mg/L）及bcl2、鼠IgG（ 205mg/L）均为DAKO公司产品；羊抗鼠FITCIgG、柠檬酸固定液由中科院上海细胞生物研究所流式细胞室提供。
　　1.4 主要仪器 96孔培养板（英国CORNINC）；CO2培养箱（德国HEREUS）；倒置显微镜（日本OLYMPUS）；博赛（BIOCELL HT）系列酶标仪（美国ANTHOS公司）；微量振荡器（北京海淀电子医疗仪器厂）；流式细胞仪（FACS－420型，美国BECKMAN COULTER公司）。
　　1.5 方法
　　1.5.1 肿瘤细胞悬液的制备 将冻存的人肺癌细胞LAC按常规方法复苏，接种于含体积分数为10%FCS的RPMI1640培养液的50mL培养瓶中，传代培养，至细胞呈指数生长期时，弃培养液，加入250g/L胰蛋白酶和0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化液37℃消化2～5min，离心弃上清液，重悬细胞于含体积分数10%FCS的RPMI1640培养液中，台盼兰染色活细胞计数，调整细胞数为1×106/mL，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100μL。
　　1.5.2 药物及浓度 阳性对照药HCPT（ 1mg/mL）和实验用药斑蝥酸钠0.05mg/mL，依据静滴给药后，药物的血浆峰值（ρ1）浓度计算公式，ρ1/（μg·ml-1）［ρ2/(mg·mL-1)为每日用药量］。实验时根据换算结果加入到细胞培养液中，进行各项实验检测。
　　斑蝥酸钠注射液成人给药量为0.5mg/ d，依上述公式计算，得出斑蝥酸钠注射液的血浆峰浓度为2.5μg/mL。据此，斑蝥酸钠注射液实验浓度设定为2.5 、12.5 、25μg/mL 3个浓度（以下简称BM1、BM2、BM3）；阳性对照药物HCPT。成人给药量为4mg/d，设定实验浓度为20μg/mL ，以生理盐水（NS）为阴性对照组。
　　1.5.3 MTT法检测细胞增殖［3］ 96孔板置于 37℃、体积分数5%CO2的饱和湿度培养箱中培养24h，实验孔分别加入HCPT10μL和BM1、BM2、BM3各10μL，对照孔加入等量NS液，每组3孔。继续培养48h，离心弃上清，每孔加入MTT（5mg/mL，10μL ），继续培养6h，再离心弃上清，加入DMSO100μL，置微量振荡器5min，即放入自动读数酶标仪，以570nm为检测波长，测各孔的吸光度（D）值，根据下列公式计算抑瘤率：p抑瘤/%=（D对照组－D实验组）/（D对照组×100% 。将实验重复3次。
　　1.5.4 流式细胞仪定量检测药物作用后肿瘤细胞凋亡 将冻存的人肺癌细胞LAC按常规方法复苏，接种于含体积分数为10%FCS的RPMI1640培养液的50mL培养瓶中，传代培养，至细胞呈指数生长期时，随机分组加药，加入斑蝥酸钠注射液2.5μg/mL(血浆峰浓度)、HCPT20μg/mL，并设NS为对照组，置37℃、体积分数5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，药物作用48h后，离心收集细胞，用体积分数70%乙醇固定，进行流式细胞仪分析。上机前离心去除固定液，采用溴化乙啶（EB）一步插入法，DNA定量荧光染色（染液含EB10μg/mL、RNA酶10μg/mL，1%Triton X100），每组设3份样品，每份样品细胞调至1×106/mL，0℃～4℃染色30min后，流式细胞仪上机检测。将实验重复3次。
　　1.5.5 流式细胞仪检测LAC细胞p53、bcl2基因的蛋白表达 细胞悬液的制备同1.5.4。上机前离心去除固定液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，分别加入1：100稀释的鼠抗人p53单抗和1：40稀释的bcl2单抗，37℃孵育30min，PBS洗2次，弃上清，加入1：20稀释的羊抗鼠FITCIgG100μL，37℃孵育30min，离心洗2次，加入1mLPBS，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。Bios Consort 30软件处理数据，计算阳性蛋白标记率。将实验重复3次。
　　1.5.6 统计学处理 结果比较用方差分析，并行两两比较的q检验，全部数据处理均在微机上用SAS6.04软件完成。
　　2 结果
　　2.1 斑蝥酸钠对LAC细胞增殖的影响
　　表1结果显示，斑蝥酸钠具有明显的抑制人肺癌LAC细胞增殖的作用，且呈剂量相关性，不同浓度之间有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），3个不同浓度组与对照组比较差异均有显著性意义（P＜0.01），其抑瘤效应优于HCPT组。
　　2.2 斑蝥酸钠对LAC细胞凋亡的影响
　　表2结果表明，斑蝥酸钠和HCPT均能明显抑制LAC细胞增殖，S期细胞明显减少，细胞被阻止于G0/G1期，部分细胞发生凋亡（21.5%和12.2%），出现亚二倍体峰（Ap），斑蝥酸钠诱导LAC细胞凋亡效应优于HCPT，两组比较有显著性差异 （P＜0.01）。
　　2.3 斑蝥酸钠对p53、bcl2基因蛋白表达的影响
　　斑蝥酸钠作用后，肺癌LAC细胞的p53基因表达上调，而bcl2基因表达下调，结果见表3、图1。表1 斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞增殖的影响(48h)表2 斑蝥酸钠作用48h细胞周期(FCM)分析p/%表3 斑蝥酸钠对肺癌LAC细胞基因表达的影响 　　3 讨论
　　随着分子生物学技术的发展，人们已经认识到，恶性肿瘤的本质在于细胞周期的调节失控，使本来应脱离细胞周期而停止增殖或应自行凋亡的细胞不断地进入细胞周期，从而出现无限制、自主的细胞增殖和分裂［4］。基因是决定细胞增殖、生长、分化的遗传因素。既往的研究表明［5-10］，肿瘤相关基因p53、 bcl2与细胞增殖、分化和凋亡密切相关。野生型p53基因除调节DNA起始复合物的装配及运行外，还能调节基因转录，从而促进或抑制mRNA的合成。在细胞周期中调节从G1期到S期的转位，并通过吞噬作用影响细胞的死亡。bcl2是一种凋亡相关基因，被激活的bcl2基因的作用是抑制细胞凋亡，下调bcl2基因及提高p53基因的表达，对肿瘤细胞有显著生长抑制作用。
　　HCPT为中草药珙垌科旱莲属植物喜树碱提取物，实验表明［11－12］，该药物能阻断细胞周期于S期，以及诱导细胞凋亡，下调bcl2基因及提高p53基因的表达对肿瘤细胞有显著生长抑制作用，在本实验选作阳性对照组。
　　本实验结果显示斑蝥酸钠注射液具有明显的抑制人肺癌LAC细胞增殖的作用，使S期细胞明显减少，细胞被阻滞于G0/G1期，部分细胞发生凋亡， 出现亚二倍体峰；使LAC细胞的p53基因的表达上调、 bcl2基因的表达下调，与对照组和HCPT组比较差异均有显著性意义（P＜0.01）。这些提示斑蝥酸钠抗肺癌的作用机制可能与周期阻滞及细胞凋亡有关，使G1期细胞不能通过细胞周期检测点进入S期而发生G0/G1期阻滞，阻断DNA合成，干扰肺癌细胞周期正常进行，从而抑制肺癌细胞的分裂增殖，以及诱导人肺癌LAC细胞凋亡来达到抗肿瘤的目的，其具体基因网络调控的变化尚有待于深入研究。
　　（本实验得到广州中医药大学第一附属医院中心实验室何玉萍老师的大力协助与支持，特此致谢）

【参考文献】
［1］Kiyokawa E，Takai S，Tanaka M，et al．Overexpression of ERK，an EPH family receptor protein tyrosine kinase，in various human tumors［J］．Cancer Res，1994，54(14)：5359．

［2］李柏，凌昌全.去甲班蝥素基础及临床研究进展［J］.中草药，2002，33:184.

［3］徐建明，宋三泰，汤仲明，等.MTT体外药敏试验指导下的乳癌预见性化疗［J］.中华肿瘤学杂志，1997，19：153.

［4］Junli Feng，Walter D Funk，Syshi Wang.The RNA component of human telomerase［J］.Science，1995，269:1236.

［5］杨烔，吴小军，丁续红，等.肺癌组织中bcl2和Bax的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系［J］.武汉大学学报医学版，2001，22（2）：120.

［6］温雪萍，程西安，王有恒，等.Bcl2蛋白在肺癌组织中的表达及其意义［J］.西安医科大学学报，2001，22（1）：41.

［7］马冬春，疏元善，魏大中，等.凋亡抑制基因bcl2产物在肺癌中表达的研究［J］.皖南医学院学报，2001，20（1）：15.

［8］许平，刘铭球.肺癌组织中凋亡相关基因bcl2、fas mRNA表达研究［J］.数理医药学杂志，2001，14（1）：22.

［9］王得坤，郑俊猛，姜海明，等.bcl2基因表达与肺癌细胞凋亡的关系［J］.癌症，2001，20（2）：168.

［10］郭雷，王福昌，杨五计，等.凋亡相关基因bcl2和bax在肺癌中的表达及意义［J］.山东医药，2001，41（1）：18.

［11］Ding X Q，Wang A X，Kong Q Y，et al．Anticancer efect of hydroxycamptothecinon oral squamous carcinoma cell line［J］．Chin Cancer，2002，21(4)：388.