关于两种功能单体制备柯里拉京分子印迹聚合物的比较

【摘要】 优选合成柯里拉京（corilagin）分子印迹聚合物的功能单体。【方法】通过评价甲基丙烯酸和丙烯酰胺两种功能单体所合成的柯里拉京分子印迹聚合物的色谱表征，考察这两种聚合物对柯里拉京模板分子的印迹作用。【结果】以丙烯酰胺为功能单体得到的聚合物分子印迹效率高于甲基丙烯酸。【结论】丙烯酰胺是合成柯里拉京分子印迹聚合物的适宜功能单体。
【关键词】 柯里拉京 分离和提纯 中药化学成分 色谱法 高压液相
　　分子印迹技术（molecular imprinting Technique，MIT）是近年来发展起来的一种合成对某一特定分子（模板分子）具有选择性的聚合物的方法，该聚合物称为分子印迹聚合物（molecular imprinting polymer，MIP）。由于MIP对目标化合物具有预定的选择性，与生物大分子相比，其制备简单，具有抗恶劣环境的能力，且耐酸碱、有机溶剂、高压等，表现出高度的稳定性和使用寿命长等优点，因此，近年来分子印迹技术飞速发展，在分离纯化、化学与生物传感器以及在药物分离和分析等方面应用广泛 ［1-5］。
　　柯里拉京（corilagin）亦称为云实精，是一种具有抗纤溶活性［6］、抗肿瘤［7-8］以及抑制乙肝病毒作用［9］的天然多酚类化合物，是叶下珠、老鹳草、蜜柑草等植物中的有效成分。柯里拉京分子印迹聚合物可用于从这些中药中萃取柯里拉京及其结构类似物。本实验以柯里拉京为模板分子，研究不同的功能单体制备的分子印迹聚合物的印迹效率。为进一步研究以该分子印迹聚合物为萃取材料，富集、萃取、分离复杂中药体系中的柯里拉京及其结构类似物提供了重要手段，这方面的研究工作尚未见报道。
　　1 材料
　　1.1 仪器 HP1100高效液相色谱仪（HPLC，USA），含一个四元泵、一个波长可调紫外检测器、一个真空在线脱气机和一个带有20μL进样环的手动六通阀；KQ100型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Senco W201 B恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）。
　　1.2 主要试剂 丙烯酰胺（AA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）、偶氮二异丁腈（AIBN）均购自百灵威化学公司；甲醇、乙腈为色谱纯；四氢呋喃（THF）、甲基丙烯酸（MAA）、醋酸均为分析纯；液相色谱用超纯水为娃哈哈纯净水；柯里拉京购自北京格润得有限公司。
　　2 方法与结果
　　2.1 柯里拉京聚合物（MIP）及空白聚合物（NIP）的制备 采用本体聚合方法。将模板分子（柯里拉京0.5mmol），溶于20mL致孔剂（体积比为CH3CN：THF = 1：1）中，加入功能单体（丙烯酰胺或甲基丙烯酸，5mmol）、引发剂偶氮二异丁腈37.5mg、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA，60mmol），超声波溶解混匀后，充氮气除氧3min，封管，60℃水浴反应24h，得到棒状聚合物。空白聚合物的制备方法同上，只是未加柯里拉京。不同功能单体制备的柯里拉京聚合物及其空白聚合物结果见表1。
　　2.2 MIP柱的制备 将得到的棒状聚合物磨碎过筛（500目，30μm），颗粒小于30μm部份用丙酮反复沉降，以除去细末，得到的聚合物真空干燥。将所得聚合物干法装柱，填充柱为4.6mm×50mm I.D不锈钢柱。将填好聚合物的柱子连接到HPLC系统中，分别用甲醇-醋酸（体积比为9：1）、甲醇为流动相在线洗脱模板分子（空白柱也要经历这一步骤，作为对照），每一种溶剂均要洗至基线稳定，以保证除去模板分子。
　　2.3 两种聚合物的色谱表征 采用HPLC法评价两种聚合物制备的色谱柱的印迹效率，考察它们对模板分子的识别能力。流动相为乙腈：甲醇（体积比为95：5），流速0.5mL／min；检测波长为270nm；柯里拉京进样体积为5μL，进样浓度为1.05mg/mL。本实验所制备的4根MIP/NIP柱均进行同样的色谱过程，分别获得4个容量因子，实验结果见表2。
　　容量因子k′，由公式（1）计算；其中tR 为柯里拉京的保留时间，t0为死时间。
　　k′=（tR-t0）／t0　　（1）
　　印迹效率（FI，imprinting efficiency）由公式（2）计算；其中，km′为柯里拉京分子在MIP上的容量因子，kb′为柯里拉京分子在NIP上的容量因子。
　　FI=km′/kb′　　（2）表1 不同功能单体制备的柯里拉京聚合物及其空白聚合物聚合物功能单体交联剂引发剂致孔剂聚合物性状MIP1甲基丙烯酸EDMAAIBNCH3CN：THF（1：1）较硬，玻璃状，米白色NIP1甲基丙烯酸EDMAAIBNCH3CN：THF（1：1）较硬，玻璃状，白色MIP2丙烯酰胺EDMAAIBNCH3CN：THF（1：1）较硬，玻璃状，米白色NIP2丙烯酰胺EDMAAIBNCH3CN：THF（1：1）较硬，玻璃状，白色表2 不同功能单体制备的聚合物对柯里拉京的印迹效率 由表2可以看出，在其他条件相同的情况下，用丙烯酰胺（AA）作为功能单体，得到的聚合物对模板分子柯里拉京的分子印迹效率较高。柯里拉京分子结构见图1。图1 Corilagin 分子结构
3 讨论
　　分子印迹聚合物多采用非共价法制备，当模板分子（印迹分子）与功能单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来。当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。MIP的分子识别就是源于其内部存在的与原模板分子空间结构互补、官能团相互作用（氢键、离子作用或范德华力等）的孔穴，MIP依靠其内部孔穴的形状、大小和化学功能基的分布对模板分子进行识别，类似于生物中酶和底物、抗体和抗原、受体和激素之间的作用，具有专一的选择性。 转贴于 由于模板分子与功能单体形成稳定的复合物是非共价分子印迹的重要条件，而目前，多数MIP聚合物颗粒是用本体聚合方法得到的，对所制备的MIP评价一般采用HPLC法，所以本实验在其他条件相同的情况下，对常用的功能单体MAA和AA进行了筛选，并用液相色谱法评价了不同单体的分子印迹效率。除了MAA、AA这两种功能单体外，4Vinylpyridine亦是常用的功能单体，但由于柯里拉京在4Vinylpyridine的反应体系中不溶，故不能用此功能单体制备柯里拉京的MIP。
　　在 MIP 制备过程中，所加入的致孔剂既要能溶解参与聚合反应的各个组分（模板分子、功能单体、交联剂和引发剂），还要使聚合物具有大的孔结构，以利于 MIP应用时的传质过程。在非共价分子印迹中，由于功能单体与模板分子形成复合物是通过氢键、静电作用等结合的，而这些作用受溶剂的影响较大。在目前的条件下，MIP基本上是采用极性较弱的溶剂如氯仿、甲苯等制备的，弱极性的溶剂有利于模板分子与功能单体之间的复合物形成。在本实验中，采用了乙腈和极性较大的四氢呋喃作致孔剂，得到了对柯里拉京具有较高印迹效率的MIP，这可能是因为含有多个酚羟基的柯里拉京分子与丙烯酰胺的结合作用较强，可以形成足够稳定的复合物。
　　模板分子的洗脱是否彻底直接关系到MIP的色谱表征以及后续的分离和模板分子的检测。对于非共价 MIP，模板分子与聚合物母体间靠氢键、静电等较弱的分子间作用结合，除去模板分子时需要用甲醇-醋酸等强极性溶剂洗脱聚合物。在本实验中采用色谱柱在线洗脱36h以上，分别用甲醇-醋酸（体积比为9：1）、甲醇为流动相，洗脱至基线平稳后才开始进行聚合物的色谱表征。
　　由于分子印迹聚合物对模板分子具有很高的选择性，因此它能特异性地将目标分子从大量的干扰成分中"钓"出来，这一优势能有效地针对中药成分复杂、有些高活性成分含量低微的特点，将一些痕量的活性成分选择性地富集出来。
　　MIP不仅对模板分子具有很高的亲和性，而且对其结构类似的化合物也表现出较高的结合能力，而对于与模板分子结构相差较远的分子，只表现出较弱的表面吸附作用。因此，我们可以利用MIP富集、萃取、分离复杂中药体系中的模板分子及其结构类似物，为活性化合物的分离提取提供了一种行之有效、简单快速的新方法，作为一种新型高效技术，分子印迹技术将在药物分离和分析中发挥出越来越大的作用。

【参考文献】
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