关于三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响

论文代写网： 【摘要】 观察三七总皂苷（PNS）对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖和体外诱导其分化为心肌样细胞的作用。【方法】 采用骨髓细胞体外培养技术分离大鼠MSCs，以流式细胞仪检测细胞表面标志；采用四甲基偶氨唑盐（MTT）法观察PNS对MSCs的增殖影响；采用第8代MSCs进行体外心肌细胞诱导分化；采用相差显微镜、免疫组化及逆转录 含酶链反应（RTPCR）鉴定心肌细胞。【结果】 大鼠MSCs细胞表面抗原CD44阳性，CD34阴性；经PNS作用后MSCs增长速度比空白对照组明显加快，体外诱导后细胞形态发生变化，其细胞免疫组化呈结蛋白（Desmin）、肌钙蛋白(cTnI)阳性；RTPCR显示诱导后细胞转录肌球蛋白重链mRNA水平增加。【结论】 PNS能促进大鼠MSCs体外增殖并可诱导MSCs分化为心肌样细胞，为细胞移植治疗心肌梗死提供了实验依据。
【关键词】 三七总皂苷/药现象 骨髓间充质干细胞/病现象 心肌梗死/中药疗法 细胞培养
　　心肌梗死后，如何促进心肌细胞的再生是心血管病学家面临的一个难题。人们一直试图寻找一种细胞移植材料以修复坏死心肌、改善心脏功能。近年来，干细胞的研究为人们提供了新的希望。骨髓间质干细胞（mesemchymal stem cells， MSCs）是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞，具有向成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等分化的能力［1］，并且在体外易于分离培养和扩增，这些特性使MSCs成为在细胞治疗中有效发挥作用的理想细胞。目前国内外多用5氮胞苷（5azacytidine，5aza）来诱导MSCs分化为心肌细胞，我们通过广泛筛选，发现三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponins，PNS）可作为MSCs分化为心肌细胞的诱导剂，为心肌损伤的干细胞移植治疗提供一种理想的细胞材料。现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验动物 纯种7周龄 SD大鼠，SPF级，雌雄不限，体质量190g，由广州中医药大学动物实验中心提供，合格证号：0004979。
　　1.1.2 主要试剂与仪器 IMDM（Iscoves modified Dulberccos medium）培养基购于Gibco公司；特级胎牛血清(FBS)购于Hyclone公司；5氮胞苷购于Sigma公司；PNS（批号：0870-200303）购于广州市药检所（纯度99％）；Percoll梯度分离液购于Pharmacia 公司；荧光标记抗大鼠抗体CD34FITC、 CD44FITC和小鼠抗人结蛋白抗体（Desmin）单抗、小鼠抗人肌钙蛋白I（cTnI）单抗购于Santa Cruz公司；链霉亲含素-生物素复合物（SABC）试剂盒及二氨基联苯胺（DAB）显色剂购于武汉博士德公司；Trizol为Gibco公司产品；聚合酶链反应（PCR）引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成；Access RTPCR试剂盒为Promega公司产品；倒置显微镜（日本，OLYMPUS）；CO2培养箱（美国力高公司）；流式细胞仪（美国BECKMAN COULTER）；PCR基因扩增仪（美国PE9600）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 MSCs的分离与培养 参照Wakitani ［2］的方法并作改进：将SD大鼠用水合氯醛腹腔麻醉，体积分数75％酒精浸泡5min，分离出股骨、胫骨；用含有肝素的IMDM培养液冲出骨髓，用吸管吹打制成细胞悬液，并移入离心管中，1000r/min离心10min； 弃上清及脂肪层，收集沉淀物用完全培养基（含IMDM、体积分数为10％FBS、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素）充分混匀，加入含1.073g/mL的Percoll分离液的离心管内，1500r/min离心20min；重复上一操作，收集中间云雾状的单核细胞层，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，用完全培养基接种于25mL培养瓶中，并标记为P"1，置37℃含体积分数5%CO2的孵箱中进行原代培养。在培养的第4天进行首次换液。在相差显微镜下观察细胞生长情况。
　　1.2.2 MSCs的传代及纯化 参照Pittenger［3］的方法并加以改进：待原代培养的细胞增殖近整个培养瓶的底面时，用胰酶消化细胞后，用培养液中止消化并反复吹打贴壁细胞，制成单细胞悬液，按1：3传代培养，并标记为P2，以后每天观察细胞的生长情况，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传至第8代。
　　1.2.3 MSCs的鉴定 取第3代MSCs，胰酶消化后，加入荧光标记的抗CD34、CD44抗体，4℃孵育30min，以多聚甲醛固定，采用FACScan流式细胞仪检查细胞表面抗原CD34和CD44。
　　1.2.4 PNS对MSCs增殖的影响 取生长良好的第4代MSCs，胰酶消化后吹散，细胞计数后调整浓度至1×104/mL，加入96孔板，每孔200μL，37℃，体积分数5%CO2饱和湿度标准环境下以诱导培养液孵育24h后，去培养液及未贴壁的细胞。实验组分别加入终浓度含PNS为50、100、150、250、400mg/L的诱导培养液各20μL，然后加上10%的胎牛血清培养液180μL，每组重复8孔，空白对照组仅为体积分数10%的胎牛血清培养液，每孔液量200μL 。37℃，体积分数5%CO2饱和湿度下孵育1、3、5d后，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法［4］检测细胞增殖水平，用酶联免疫检测仪570nm波长处测光吸收值（D）。
　　1.2.5 骨髓MSCs的诱导分化 将传至第8代的MSCs进行实验。实验分4组：①组PNS（浓度分别为50、100、150、250、400mg/L)，②组5aza组（浓度为10μmol/L），③PNS+5aza组（浓度分别为150mg/L、 10μmol/L），3组都是诱导24h后改用完全培养液继续培养，并设空白对照组以IMDM基本培养基培养24h，后改用完全培养液继续培养。每3d换液1次，并观察细胞形态变化，连续4周。
　　1.2.6 心肌样细胞转化率的计算 采用共聚焦荧光显微镜观察高倍视野下（×100）每个视野内（每孔随机取3个视野）的细胞数（ncells）和阳性细胞数（npositive cells）。计算大鼠骨髓基质细胞分化为心肌样细胞的转化率：p转化/％=npositive cells/ncells×100%。
　　1.2.7 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件对数据进行处理，采用oneway ANOVA方差分析进行统计学处理。
　　1.2.8 免疫组织化学鉴定 分别取诱导后4周的细胞用丙酮固定30min，并冻存2h，取出后放入PBS液中浸泡，用羊血清封闭10min后弃去，分别滴加Desmin（1：50）与cTnT（1：50）于标本上，37℃ 孵育1h， PBS振洗，滴加生物素化二抗，37℃孵育15min后用PBS振洗，滴加SABC，37℃孵育15min后用PBS振洗，用DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯、中性树脂透明、封固。显微镜观察，胞质中有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。阳性对照用正常心肌组织，阴性对照用PBS分别代替一抗Desmin与cTnI。
　　1.2.9 RTPCR鉴定 分别检测正常大鼠心肌细胞和诱导前、诱导后4周细胞的α心肌肌球蛋白重链（αMHC）和β心肌肌球蛋白链（βMHC）mRNA的表达。用胰酶消化后收集细胞，约5×106个/mL， Trizol裂解细胞，提取细胞总RNA。RTPCR采用Promega一步法试剂盒，按操作说明进行，先48℃、45min合成cDNA， 再95℃变性2min，接着35个循环扩增 （95℃、30s，65℃、1min，72℃、1min），最后72℃ 延伸7min。引物按Genbank进行设计， αMHC上游引物：5GGAAGAGTGAGC GGCCATCAAGG3，下游引物：5CTGCTGGAGAGG TTATTCCTCG3，扩增产物长度为305bp；βMHC上游引物：5TTCCAGCCTTCCTTCCATGG3，下游引物：5TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT3，扩增产物长度为540bp。PCR结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在紫外灯下观察目的条带，并摄影记录。
　　2 结果
　　2.1 MSCs形态特性 原代培养的MSCs细胞，4～6h后开始贴壁， 24h后大部分MSCs均已贴壁（附图1-a）。3～4d后细胞呈集落生长，逐渐汇合成片，其形态多变化为短梭形或针尖状，可见核仁，7～10d基本铺满瓶底。传代后细胞于24h内完全贴壁，传代第3天可见细胞体积较原代细胞增大，大部分呈扁平多角形、梭形或纤维状等多种形态，胞浆透明，胞核明显。
　　2.2 MSCs表面抗原的鉴定 应用FACScan流式细胞仪检查细胞表面抗原CD34和CD44，结果显示细胞均一性较好，在95％以上，CD34表达为阴性，CD44表达为阳性。
　　2.3 MSCs诱导后的形态变化 三七总皂苷、5－氮胞苷诱导后，细胞形态从原来的成纤维状变为排列趋于较为一致的长梭形，且体积增大，之后，部分细胞脱壁死亡，细胞数量较诱导前减少，诱导后4周，细胞周围伸出较多长的突起，体积大小不等，呈梭形，有纤维样结构存在（附图2）。
　　2.4 PNS对MSCs增殖的影响 表1结果表明：无论PNS浓度高低，第1、3天细胞均呈增殖趋势，第5天呈抑制趋势。第1天， 50、100、150、250mg/L的PNS组细胞保持较强的增殖，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；第3天，细胞增殖略弱，但50、150、250mg/LPNS组，与空白对照组比较D值增加（P＜0.05）。第5天，除50mg/LPNS组外，随着浓度升高，其他各组细胞增殖呈明显抑制（P＜0.05）(表1)。
　　2.5 诱导MSCs的免疫组化鉴定 未诱导 MSCs的空白组中未发现Desmin、cTnI阳性细胞，已诱导 MSCs的①、②、③组中Desmin免疫组化染色均可见强阳性免疫复合物，呈集落样分布，阳性率约为 36％（图2-a）。在已诱导 MSCs的①、②、③组中均发现cTnI阳性细胞，阳性率约为 18％，胞质中可见明显的肌原纤维结构，阳性细胞散在分布，呈梭形和成纤维细胞样形态（图2-b）。
　　2.6 RTPCR检测诱导后的MSCs心肌特异因子的表达 与正常大鼠心肌细胞α心肌肌球蛋白重链（αMHC）、β心肌肌球蛋白重链（βMHC）阳性条带作对照，PNS组（浓度为150mg/L）、5aza组、PNS+5aza组诱导MSCs1～2周后，αMHC即有低强度的表达，随后表达强度显著提升，4周时达到高峰，而后随时间的延长，5周、6周后其表达强度则缓慢减弱，各诱导组均在305bp处出现同一条阳性条带（图3-a、图4-a）。
　　同样，在MSCs诱导1～2周后，βMHC即有低强度的表达， 4周时达到高峰，而后随时间的延长，其表达强度则迅速减弱，各诱导组均在540bp处出现同一条阳性条带（图3-b、图4-b） 。而未加药组未见阳性条带出现。
　　2.7 心肌样细胞分化率 表6结果表明：PNS组（浓度为150mg/L）、5aza组、PNS+5aza组均能够诱导MSCs分化为心肌样细胞，各组之间比较无显著性差异（P＜0.05）。表1 PNS对MSCs增殖的影响表2 PNS诱导对MSCs分化为心肌样细胞的影响
　　3 讨论
　　目前，为使心梗后心肌修复成为可能并为骨髓细胞移植提供理论基础，国内外学者多采用5－氮胞苷来诱导MSCs分化成心肌细胞［5-7］，本研究也证实了5－氮胞苷能诱导MSCs分化成心肌细胞，另有国内学者尝试用三七皂甙诱导小型家猪MSCs分化心肌样细胞［8］，本实验采用不同方法证实了PNS也能诱导大鼠MSCs转化成心肌样细胞。
　　本研究采用密度梯度分离法与贴壁法相结合来获取MSCs并进行传代培养，在传至第8代可使MSCs接近永生化状态［9］，未分化的永生化MSCs对诱导成功很关键。
　　对于MSCs的鉴定，一般认为CD34表达骨髓造血干细胞，而CD44表达MSCs，我们分离大鼠的MSCs经流式细胞仪检测，发现CD34表达阴性，CD44表达阳性，结果表明用该法得到的细胞为均一的细胞群，这些细胞具有独特的表型与文献报道相一致［10］。 本实验以不同梯度浓度的PNS观察其对MSCs的增殖作用，结果表明，短期（第1、3天）低浓度（50mg/L）时PNS促进MSCs增殖，长期（第5天）高浓度（250、400mg/L）PNS则明显抑制MSCs增殖。根据MTT细胞增殖实验，本研究发现150mg/L的PNS，第 3天对MSCs的增殖效果较好，为最佳效验浓度。实验中我们采用PNS的上述浓度诱导大鼠MSCs分化的心肌细胞，取得较好结果。
　　本研究通过免疫组化发现MSCs诱导后与未诱导的MSCs完全不同，诱导组Desmin、cTnI均有表达，而未诱导组的MSCs则不表达。Desmin作为心肌细胞分化的一种标志已经得到公认，它是一种心肌细胞较早出现的细胞骨架蛋白，形成心肌细胞的中介性细纤维，对维持肌肉细胞的收缩装置起重要作用［11］。cTnI仅存在于心房肌和心室肌中，是鉴定心肌细胞的特异性蛋白。Desmin、cTnI的阳性结果表明转化的心肌细胞包含了心肌特异性的基因和蛋白。
　　MHC为心肌特异性蛋白，有αMHC和βMHC两种亚型，前者见于胚胎型心肌细胞，而后者在成熟心肌细胞中表达。βMHC蛋白含量在一定程度上反映MSCs向心肌细胞的分化情况，其基因表达水平是观察MSCs向成熟心肌细胞分化的重要指标之一［12］。本研究发现：经PNS、5aza诱导24h后继续培养，MSCs表达成熟的αMHC、βMHC。
　　关于5aza诱导MSCs分化为心肌样细胞的机制可能与5aza引起细胞DNA中的胞嘧啶去甲基化有关［13］，而PNS诱导MSCs分化心肌样细胞机制目前尚未清楚。有研究表明：PNS能刺激人骨髓红系、粒系造血祖细胞增殖和分化［14-15］，提示可能机制为诱导造血微环境中的成纤维细胞、淋巴细胞等分泌较高活性的调控因子和(或)协同生长因子［16-17］。PNS在诱导MSCs转变为心肌样细胞中的作用估计与其抗氧化作用及分泌某些诱导因子有关，但确切机制尚有待于进一步探讨。
　　本研究初步探讨了PNS诱导骨髓 MSCs分化为心肌样细胞的研究，发现无论从分化细胞的形态、免疫组化，还是细胞特征性基因表达，都表明骨髓MSCs在体外诱导剂PNS作用下已向心肌样细胞转化，具有心肌细胞的特性。这为推动应用骨髓MSCs治疗心肌梗死或心肌损伤，为细胞工程治疗有关疾病提供了一种新思路。
　　在心肌细胞诱导率方面，文献报道5aza的诱导率约为30％～35％［18］，但本研究尚未发现PNS、5aza及PNS+5aza 3组有明显差异。因此，如何提高三七总皂苷的心肌细胞诱导率及诱导机制，为MSCs体外定向分化为心肌细胞并为移植修复损伤心肌提供理论基础，将是我们面临的下一个课题。

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