关于麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑含水量及血脑屏障通透性的影响

【摘要】 观察麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑含水量及血脑屏障（bloodbrain barrier，BBB)通透性的影响。【方法】将SD大鼠30只随机分为6组：假手术组、模型组、麝香组（剂量为1mg·kg-1·d-1)、冰片组（剂量为3mg·kg-1·d-1)、麝香配伍冰片组、尼莫地平组（剂量为12mg·kg-1·d-1)；采用颈内动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，干湿质量法观察脑含水量的变化，通过收集透出脑血管外的伊文思蓝（Evans blue，EB)来示踪BBB的变化。【结果】脑缺血2h再灌注24h，模型组较假手术组脑含水量及脑皮质EB含量显著性增加（Ｐ＜０.０１），血脑屏障遭到破坏；麝香配伍冰片组脑含水量较模型组显著性降低（Ｐ＜０.０５），而且麝香配伍冰片组及冰片组脑皮质EB含量较模型组显著性降低（Ｐ＜０.０１）。【结论】麝香配伍冰片可有效降低脑缺血再灌注后脑含水量及血脑屏障的通透性，对血脑屏障结构具有一定的保护作用。
【关键词】 脑缺血 中药疗法 药理学 冰片 药理学 中药配伍 血脑屏障 疾病模型 动物 大鼠
　　缺血性脑水肿是脑血管病中最常见的死亡原因，是脑梗死必然且重要的病理过程。缺血性脑血管病导致的脑水肿主要由于脑缺血再灌流期间血脑屏障（ＢＢＢ）破坏，这是缺血性脑损伤的重要病理基础。麝香、冰片是中医治疗脑血管病常用的药物，具有开窍醒神的作用。我们的前期研究发现，麝香配伍冰片能显著缩小局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积并可明显改善神经功能损害，对全脑缺血再灌注损伤大鼠亦有脑保护作用［1-4］。
　　本研究采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，通过观察脑含水量及透出血管外伊文思蓝（ＥＢ）含量的变化来探讨麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠ＢＢＢ的影响，为临床防治脑血管病提供实验依据。现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物
　　SPF级ＳＤ大鼠３０只，雌雄兼用，体质量260～300g，广东省医学实验动物中心提供，合格证号：SCYY（粤）20030001。
　　1.2 药物
　　人工麝香（批号：20050322）、冰片（批号：２０００３２３）由广东致信中药饮片有限公司提供，广东省中药质量监测站检验合格。分别以体积分数为１％吐温配成麝香、冰片悬浊液（每毫升含人工麝香0.1mg、冰片0.３mg）；尼莫地平由德国拜耳公司生产（批号：１０３７２８），用体积分数为１％吐温配成悬浊液（每毫升含尼莫地平１.２mg）。
　　1.3 仪器及试剂
　　伊文思蓝由Sigma 公司生产；二甲基甲酰胺由Sigma 公司生产；FX42型电热恒温干燥箱由Shellab公司生产；BT224S电子天平由Sartorius 公司生产；Ｕ２００１型紫外分光光度计由Hitachi公司生产。
　　1.4 动物分组与给药
　　大鼠随机分为６组，即假手术组、模型组、麝香组（剂量为1mg·kg-1·d-1）、冰片组（剂量为3mg·kg-1·d-1）、麝香配伍冰片组、尼莫地平组（剂量为12mg·kg-1·d-1），每组5只。各组大鼠用药量按体表面积公式计算，药物灌胃量为10mL·kg-1·d-1，假手术组与模型组给予体积分数１％吐温溶液1０mL·kg-1·d-1灌胃。各组在造模前12h给药1次，再于缺血前30min给药1次，缺血后12h与24h各给药1次（共给药4次）。
　　1.5 模型制备
　　参照Longa等［5］的线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型。术前禁食１２h，自由饮水；实验前腹腔注射100g/L水合氯醛（０.３５g/kg)麻醉，取大鼠腹侧颈部正中手术切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉，颈内动脉和翼腭动脉；结扎翼腭动脉，然后在距颈总动脉分叉1cm处结扎颈外动脉，并于颈外动脉远心端用电凝器灼断；动脉夹夹闭左颈总动脉，在颈外动脉距结扎处近心端约０.５cm处剪一切口，将尼龙线栓经右侧颈外动脉主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进１８～２０mm感到轻微阻力时，即阻断大脑中动脉；阻断２h后，拨出尼龙线，扎紧动脉残端，缝合皮下组织和皮肤，完成缺血再灌注损伤模型。假手术组除不插线外，全过程同其他各组。
　　1.6 脑含水量测定
　　采用干湿质量法测定缺血侧脑含水量。脑缺血再灌注２４h后处死大鼠，快速断头取脑，滤纸擦去表面水分，取缺血侧半边大脑，置天平内精密称取湿质量，然后置110℃电烤箱２４h，再迅速测干质量。计算脑含水量：p含水，脑/%=（m湿脑-m干脑）/m湿脑×100%。1.7 伊文思蓝标准曲线制备
　　将二甲基酰胺配制的伊文思蓝母液按倍比稀释法配制成不同浓度（５0～１ ０００ng/mL），在分光光度计上测定其吸光度，测定波长为620nm，以浓度（ρ）为横坐标，以吸光度（Ｄ）为纵坐标，求得回归方程Y=0.042 3X+0.044 7，r=0.999。
　　1.8 伊文思蓝含量测定
　　ＢＢＢ的通透性是按照Uyama等［6］的方法加以改进，通过渗出血管外的ＥＢ来评价的。在再灌注23h时用100g/L水合氯醛麻醉大鼠（350mg/kg），经股静脉注入20g/LEB生理盐水溶液（３mL/kg）1h后，开胸通过左心室灌注生理盐水，直到右心耳流出的液体无色为止，断头取脑，滤纸吸干大脑表面水分，取缺血侧大脑皮层，电子天平精确称取其湿质量后，放入试管，分别加入4mL二甲基甲酰胺，加盖后于50℃的水浴箱孵育４８h，再离心１５min（３ ００0r/min），取上清液采用分光光度计测定其吸光度，测定波长定为620nm。根据ＥＢ溶液标准曲线，计算ＥＢ的含量。
　　1.9 统计处理
　　采用SPSS 11.0软件进行统计处理。
　　2 结果
　　表1结果表明，与假手术组比较，模型组缺血侧脑含水量及脑皮质ＥＢ含量增加（均Ｐ＜０.０１）；与模型组比较，麝香配伍冰片组缺血侧脑含水量降低（Ｐ＜０.０５），麝香配伍冰片组及冰片组缺血侧脑皮质ＥＢ含量显著性降低（Ｐ＜０.０１）。表1 各组脑组织含水量及EB含量的比较统计方法：方差分析；①：Ｐ＜０.０１，与假手术组比较（vs the shamoperation group）;②：Ｐ＜０.０５，③：Ｐ＜０.０１，与模型组比较（vs the model group)
　　3 讨论
　　ＢＢＢ受损是缺血性脑水肿重要的病理环节。缺血早期为细胞毒性水肿，是构成细胞内液体聚集的主要原因。缺血后数分钟，缺血区毛细血管内皮细胞及周围的胶质细胞即开始肿胀，持续肿胀引起ＢＢＢ破坏，毛细血管通透性增加，此时即由细胞毒性水肿过渡到血管源性脑水肿。因此，脑水肿的治疗原则首先是稳定ＢＢＢ，以不至于非常显著地改变或严重破坏其通透性，防止渗出物大量分流到组织间隙或细胞间隙［7］。
　　中医没有缺血性脑水肿的病名，但早在张仲景《金匮要略》中就提出了"血不利则为水"的病机观，也就是说各种原因所致的血脉不利，血行不畅，必然会导致水液代谢障碍，引起水液停聚。若水液停聚于脑窍，则易引起窍闭，严重可出现神昏。这种认识与现代医学中的缺血性脑水肿形成机理在一定程度上吻合。因此，我们认为缺血性脑水肿是脑窍闭阻的主要病理环节，故开窍醒脑是治疗关键。
　　麝香、冰片作为中医开窍醒脑的传统药对组合，一直受到到历代医家的重视，在古代两者常配伍运用于中风神昏治疗，著名的"三宝"中均含麝香及冰片，是芳香开窍醒神的主要成分。临床上麝香、冰片常相须为用，具有开窍醒脑、通脉活血的作用，是芳香开窍法的代表药对。两者气味芳香，善于走窜，且冰片能助麝香通诸窍，与麝香配伍可起到协同增效的作用。 药理作用表明：麝香能很快透过血脑屏障进入脑组织，吸收快，发挥药效迅速，直接作用于中枢神经系统，可延长小鼠在常压下缺血环境中的存活时间，能明显减轻脑缺血缺氧及脑水肿，能显著减轻以毛细血管和星形胶质细胞及其足突引起的脑水肿，减轻神经细胞损害［8-9］。冰片常作为脑部病变的引经药，独行则势弱，佐使则有功，其脂溶性强，在胃肠道吸收迅速，5min即可通过血脑屏障，在脑中蓄积量高，能提高治疗药物在脑中的浓度，具有镇静、耐缺氧等作用，并且抑制细胞间粘附因子1（ICAM1）的表达，减少缺血性脑水肿、脑炎性脑水肿及外伤性脑水肿［10］。
　　ＢＢＢ是维持脑内微环境稳定、保障大脑正常功能的重要生理屏障［１１］。脑缺血再灌注的情况下，血脑屏障的结构和功能发生改变，屏障作用受损，通透性增加，生理状态下不能通透的物质可以穿越血脑屏障，到达组织间隙。ＥＢ与血浆蛋白结合，采用分光光度计法检测渗入脑组织的ＥＢ含量，可作为血脑屏障损害、血浆蛋白外渗、血管源性脑水肿的观察指标。有研究显示：血脑屏障的结构和通透功能改变与缺血后再灌注的时间密切相关，缺血后再灌注24h达到高峰［12］。我们采用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型，缺血２h再灌注２４h后，模型组缺血侧脑含水量及脑皮质ＥＢ含量均明显增加，与假手术组比较有显著性差异，表明脑缺血再灌注后可致ＢＢＢ的损害，使脑含水量及ＢＢＢ通透性增加，但给予麝香、冰片混合液后脑含水量及ＢＢＢ通透性均降低，与模型组比较有显著性差异，且麝香配伍冰片组效果要稍优于冰片组。表明麝香配伍冰片可有效降低脑缺血再灌注后脑含水量及血脑屏障的通透性，对血脑屏障结构有一定的保护作用。
　　近年的药理学研究发现冰片有明显的促透及开放血脑屏障的作用，如王宁生等［１３］以ＣＴ动态扫描研究冰片作为使药的作用，发现冰片能增加泛影葡胺在脑内的ＣＴ值，提示冰片能增加ＢＢＢ的通透性。刘启德等［１４］研究发现冰片不但能增加血脑屏障的通透性，使庆大霉素进入脑内的量增加，而且能提高血清中庆大霉素的浓度。但值得注意的是这些多为生理性的开放。如赵保胜等［１５］的研究即发现冰片促ＢＢＢ开放与脑炎、脑外伤的病理性开放有质的区别，其开放为生理开放，冰片对脑及ＢＢＢ有一定的保护作用，其促血脑屏障开放不会引起脑的病理性损害。因此基于本研究结果，我们认为冰片对ＢＢＢ可能存在双向调节作用，但其对ＢＢＢ的具体的调控机制如何还有待于进一步深入研究。

【

参考文献

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